Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Aislamiento de eritrocitos a partir de sangre total
- Añadir 500 μL de sangre total en citrato ácido dextrosa (ACD) (almacenado a 4 °C) a un tubo de microcentrífuga.
nota: La sangre entera se compró en ACD. Según la compañía, se añaden 1,5 mL de ACD a 7 mL de sangre total (8,5 mL de volumen total).
- Centrifugar la sangre entera a 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y eliminar el plasma transparente y la fina capa leucitaria con una pipeta para dejar la capa de eritrocitos rojos.
- Prepare 1 L de solución Ringer que contenga 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 32 mM de HEPES, 5 mM de glucosa y 1 mM de CaCl2. Ajuste el pH a 7,4 añadiendo 2 μL de gotas de NaOH 1,0 M. Para preparar una solución de Ringer sin glucosa, siga el mismo protocolo, pero no incluya glucosa en la solución.
- Lave los eritrocitos 2 veces en la solución de Ringer suspendiendo el pellet de la célula en 1,5 ml de solución de Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT y eliminando el sobrenadante.
- Realizar un hematocrito al 0,4% resuspendiendo 40 μL del pellet de eritrocitos en 9.960 μL de solución de Ringer sin glucosa para alcanzar un volumen final de 10 mL.
nota: Hematocrito es un término utilizado para referirse a la fracción de volumen de los eritrocitos en suspensión. Un hematocrito al 0,4% es una suspensión que contiene un 0,4% de eritrocitos.
- Incubar la suspensión celular a 37 °C durante 7 días.
2. Tratamiento de eritrocitos con ionomicina y medición de la hemólisis
- Disolver 1 mg de sal cálcica de ionomicina en 630 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Alícuota y almacenar a -20 °C.
- Tomar 1 mL del hematocrito al 0,4% del paso 1.5 y añadir 0,5 μL de ionomicina 2 mM para alcanzar una concentración final de 1 μM. Incubar durante 2 h a 37 °C.
- Utilice 1 mL del hematocrito sin tratamiento con ionomicina como control negativo.
- Centrifugar los hematocritos tratados con ionomicina y sin tratar a 700 x g durante 5 min en RT y eliminar sus sobrenadantes para dejar los gránulos celulares en el fondo de los tubos.
- Lave las células 3 veces con la solución de Ringer suspendiendo los gránulos de la célula en 1,5 ml de solución de Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min a RT y desechando los sobrenadantes.
- Para medir la hemólisis, añadir 1 mL del hematocrito al 0,4% sin tratar del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga e incubar durante 2 h a 37 °C como control negativo para la hemólisis (0%).
- Añadir 1 mL del hematocrito al 0,4% sin tratar del paso 1,5 a un tubo de microcentrífuga y centrifugar a 700 x g durante 5 min en RT. Retirar el sobrenadante y añadir 1 mL de agua destilada al pellet de la célula e incubar durante 2 h a 37 °C como control positivo de hemólisis (100%).
- Añada 1 ml del hematocrito al 0,4% tratado con ionomicina del paso 2.2 a un tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar las células no tratadas, las células tratadas y las células en agua destilada a 700 x g durante 5 min en RT.
- Tome 200 μL de los sobrenadantes y agréguelos a una placa de 96 pocillos.
- Mida la absorbancia a 541 nm utilizando un lector de microplacas.
- Calcule la hemólisis usando la ecuación 1:
%hemólisis = (AT - A0)/(A100 - A0)*100
donde A0 es la absorbancia de los eritrocitos en la solución de Ringer, A100 es la absorbancia de los eritrocitos en el agua y AT es la absorbancia de los eritrocitos tratados por la ionomicina.
