Ensayo de unión a anexina V: una técnica basada en fluorescencia para identificar eritrocitos apoptóticos mediante el marcaje con fosfatidilserina

Resumen

Fuente: Bigdelou, P., et al. Inducción de eriptosis en glóbulos rojos utilizando un ionóforo de calcio. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el ensayo de unión a la anexina V para medir el grado de eriptosis, muerte celular programada con eritrocitos, utilizando la tinción fluorescente de anexina V. Los eritrocitos apoptóticos muestran una translocación de fosfatidilserina desde la valva interna a la externa de la membrana celular, lo que hace que la anexina V marcada con fluoróforos se una a la fosfatidilserina translocada, emitiendo así una señal fluorescente.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Ensayo de unión a la anexina-V

1. Disolver 1 mg de sal cálcica de ionomicina en 630 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Alícuota y almacenar a -20 °C.
2. Tomar 1 mL de hematocrito al 0,4% y añadir 0,5 μL de ionomicina 2 mM para alcanzar una concentración final de 1 μM. Incubar durante 2 h a 37 °C.
3. Centrifugar los hematocritos tratados con ionomicina y no tratados a 700 x g durante 5 min en RT, y eliminar sus sobrenadantes para dejar los gránulos celulares en el fondo de los tubos.
4. Lave las células 3 veces con la solución de Ringer suspendiendo los gránulos de la célula en 1,5 ml de solución de Ringer, centrifugando a 700 x g durante 5 min a RT y desechando los sobrenadantes.
5. Vuelva a suspender los gránulos de células de eritrocitos tratados con ionomicina y sin tratar en 1 mL de tampón de unión 1x.
6. Diluya 2 mL del tampón de unión 5x anexina V en 8 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener 1x tampón de unión.
7. Tome 235 μL de las suspensiones celulares en el tampón de unión y agregue 15 μL de anexina V-Alexa Harina 488 conjugado.
8. Incubar las células a temperatura ambiente (RT) durante 20 minutos en un lugar oscuro. Centrifugar a 700 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante.
9. Lave las células 2 veces con tampón de unión 1x, suspendiendo el pellet de la célula en 1,5 mL del tampón de unión, centrifugando a 700 x g durante 5 min en RT y eliminando el sobrenadante.
10. Vuelva a suspender los gránulos celulares en 250 μL de tampón de unión 1x para mediciones de citometría de flujo.

2. Citometría de flujo

1. Transfiera 200 μL de los eritrocitos teñidos con anexina V a tubos de poliestireno de fondo redondo de 1 mL compatibles con citometría de flujo.
2. Inicie sesión en el software de citometría de flujo y haga clic en el botón nuevo experimento. Haga clic en el botón nuevo tubo. Seleccione la hoja global y elija el análisis de aplicación para medir la intensidad de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm.
3. Establezca el número de células en 20.000 que se recogerán para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
4. Seleccione el tubo deseado y haga clic en el botón de carga. Haga clic en el botón de grabación para obtener mediciones de dispersión directa y dispersión lateral. Repita para todas las muestras.
5. Haga clic con el botón derecho en el espécimen y haga clic en aplicar análisis por lotes para generar el archivo de resultados.
6. Haga clic con el botón derecho en el botón de muestra y haga clic en generar archivos FSC.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anexina V Alexa Fluor 488 - kit de apoptosis	Fisher Científico	A10788	Almacenar a 4 °C
Citómetro de flujo BD FACSAria II	BD Biociencias	643177
Ionomicina sal cálcica	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Se disuelve en DMSO hasta alcanzar 2 mM. Conservar a -20 °C
centrífuga	Millipore Sigma	M7157	Modelo Eppendorf 5415C
Tubo de citometría de flujo de fondo redondo desechable	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Científico	C79-500
DPBS	Ciencias de la vida de VWR	SH30028.02
Tubo de microcentrífuga	Fisher Científico	02-681-5
Sangre entera en ACD	Zen-Bio		Almacenar a 4 °C y calentar a 37 °C antes de usar