Ensayo de unión a anexina V: una técnica basada en fluorescencia para identificar eritrocitos apoptóticos mediante el marcaje con fosfatidilserina

Abstract

Fuente: Bigdelou, P., et al. Inducción de eriptosis en glóbulos rojos utilizando un ionóforo de calcio. J. Vis. Exp. (2020)

En este video, demostramos el ensayo de unión a la anexina V para medir el grado de eriptosis, muerte celular programada con eritrocitos, utilizando la tinción fluorescente de anexina V. Los eritrocitos apoptóticos muestran una translocación de fosfatidilserina desde la valva interna a la externa de la membrana celular, lo que hace que la anexina V marcada con fluoróforos se una a la fosfatidilserina translocada, emitiendo así una señal fluorescente.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.

1. Ensayo de unión a la anexina-V

1. Disolver 1 mg de sal cálcica de ionomicina en 630 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para alcanzar una concentración final de 2 mM. Alícuota y almacenar a -20 °C.
2. Tomar 1 mL de hematocrito al 0,4% y añadir 0,5 μL de ionomicina 2 mM para alcanzar una concentración final de 1 μM. Incubar durante 2 h a 37 °C.
3. Centrifugar los hematocritos tr....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anexina V Alexa Fluor 488 - kit de apoptosis	Fisher Científico	A10788	Almacenar a 4 °C
Citómetro de flujo BD FACSAria II	BD Biociencias	643177
Ionomicina sal cálcica	EMD Milipore Corp.	407952-1MG	Se disuelve en DMSO hasta alcanzar 2 mM. Conservar a -20 °C
centrífuga	Millipore Sigma	M7157	Modelo Eppendorf 5415C
Tubo de citometría de flujo de fondo redondo desechable	VWR	VWRU47729-566
CaCl2	Fisher Científico	C79-500
DPBS	Ciencias de la vida de VWR	SH30028.02
Tubo de microcentrífuga	Fisher Científico	02-681-5
Sangre entera en ACD	Zen-Bio		Almacenar a 4 °C y calentar a 37 °C antes de usar