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NOTA: Como punto de referencia conveniente para los lectores, la siguiente metodología describe las condiciones de cultivo específicas y los materiales necesarios para la medición de la biodisponibilidad de Fe de 20 muestras experimentales, además de los controles de calidad requeridos, en una ejecución del bioensayo. No se recomienda aumentar el número de muestras más allá de esta capacidad debido al tiempo requerido para varios pasos de cultivo celular y digestión in vitro dentro del bioensayo.
1. Elegir la cantidad de muestras
- En el caso de los alimentos sólidos o líquidos, determine una cantidad de alimento que pueda considerarse representativa de la muestra que se va a analizar.
- En las pruebas de biodisponibilidad de Fe de una variedad de frijol, use 100-150 g de semilla de frijol y procese esta cantidad hasta obtener una muestra homogénea.
- En el caso de muestras líquidas como jugos fortificados, productos lácteos y bebidas deportivas, asegúrese de que los alimentos estén bien mezclados antes de la muestra.
NOTA: La cantidad de material de semilla de frijol mencionada anteriormente es esencial para tener en cuenta las diferencias inherentes entre las semillas de este cultivo básico.
2. Preparación de muestras
- Enjuague la tierra y el polvo de cualquier muestra de alimento con agua destilada y desionizada antes de procesar.
- Procese la cantidad adecuada de muestra según los objetivos experimentales, por ejemplo, mediante el método de cocción y molienda.
NOTA: Para cocinar y procesar, es fundamental utilizar utensilios y equipos de cocina que no sean una fuente potencial de contaminante Fe. Los equipos de acero inoxidable no contaminan; sin embargo, equipos como molinos de piedra, utensilios de cocina de hierro fundido y cualquier equipo que no sea de acero inoxidable que contenga Fe pueden agregar cantidades significativas de Fe contaminante. Un molinillo de café estándar de acero inoxidable suele ser adecuado para moler.
- Liofilizar y moler hasta obtener un polvo homogéneo.
NOTA: Una vez homogeneizados, las investigaciones han demostrado que tres réplicas independientes de análisis son adecuadas para cada alimento que se está midiendo.
- Si es difícil lograr la homogeneidad de la muestra, revise la formulación o el procesamiento del producto. Si esto no es posible, agregue replicaciones si la falta de homogeneidad no es grave.
- Para la mayoría de los alimentos sólidos homogéneos, utilice 0,5 g de muestra liofilizada por réplica. Si es necesario, utilice hasta 1,0 g de muestra por réplica, pero compruebe si más de 0,5 g produce un beneficio en el grado de respuesta.
NOTA: Las cantidades superiores a 0,5 g de alimentos sólidos pueden obstruir la membrana de diálisis (ver más abajo).
- Utilice 1-2 mL de muestras líquidas.
nota: La liofilización a menudo no es necesaria para las muestras líquidas.
3. Cultivo de células Caco-2
- Cultivos de stock
- Adquiera celdas Caco-2 de un proveedor certificado.
- Cultivo de las células de viales madre a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de aire con 5% de CO2 (humedad constante) utilizando el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 25 mM de HEPES (pH 7,2), suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v) y solución antibiótica-antimicótica al 1%.
- Una vez que se dispone de suficientes células, normalmente después de 7-10 días de cultivo, se siembran las células en matraces no recubiertos de colágeno a una densidad de 30.000 células/cm2.
- Elija el tamaño del matraz en función del número de celdas disponibles y necesarias para sembrar placas de pocillos múltiples.
NOTA: En general, los matraces T225 (225 cm2) funcionan mejor para experimentos en los que se utilizan 11 placas multipocillos (6 pocillos; 9,66 cm2/pocillo) (10 placas para comparaciones de muestras, 1 placa para controles de calidad) por bioensayo.
- Cultive las células en matraces durante 7 días, cambiando el medio cada dos días, y utilícelas al 7º día para sembrar las placas de pocillos múltiples.
NOTA: Se recomienda utilizar un intervalo de pasajes de no más de 10-15 pasajes desde que las células se inician a partir de un cultivo en stock y posteriormente se utilizan en una serie de experimentos. Los pasajes de cultivo celular deben limitarse, ya que una amplia gama de pasajes puede dar lugar a cambios adaptativos en la línea celular y, por lo tanto, a la variabilidad en la respuesta del modelo.
- Cultivo celular en placas multipocillo
- Siembre las células de Caco-2 a una densidad de 50.000 células/cm2 en placas recubiertas de colágeno de 6 pocillos.
NOTA: Este paso suele funcionar mejor si se realiza un miércoles. Los siguientes pasos harán evidente por qué este día de la semana es óptimo.
- Cultive las células durante 12 días a 37 °C en una incubadora con una atmósfera de aire con 5% de CO2 (humedad constante) utilizando DMEM suplementado con 25 mM HEPES (pH 7,2), 10% (v/v) de FBS y 1% de solución antibiótica-antimicótica.
NOTA: El cultivo de las monocapas celulares durante más de 12 días puede resultar en un crecimiento excesivo de la célula. Investigaciones anteriores han demostrado claramente que, en estas condiciones, a los 12 días después de la siembra, la monocapa celular está madura, bien adherida a la placa y óptima en la consistencia de la respuesta. El crecimiento de las células durante más tiempo, como hasta 19-21 días, da como resultado un crecimiento excesivo de las células, y el medio se agota rápidamente en nutrientes, lo que da como resultado monocapas poco saludables.
- Durante el período de 12 días, cambie el medio al menos cada 2 días en un horario diario constante.
- En el12º día después de la siembra, reemplace el medio de cultivo con 2 mL de Medio Esencial Mínimo (MEM [pH 7]) suplementado con 10 mM de PIPES (piperazina-N,N'-bis-[ácido 2-etanosulfónico]), solución antibiótica-antimicótica al 1%, hidrocortisona (4 mg/L), insulina (5 mg/L), selenio (5 μg/L), triyodotironina (34 μg/L) y factor de crecimiento epidérmico (20 μg/L).
NOTA: Si la siembra se inició un miércoles, entonces el día 12 sería un lunes.
- Al día siguiente (es decir, el día 13), retire el MEM y reemplácelo con 1 mL de MEM (pH 7).
NOTA: Este paso ocurriría un martes. Este es el día en que comienza el bioensayo; Por lo tanto, el programa de 13 días ofrece la ventaja de un programa semanal consistente, lo que permite que el bioensayo se realice de manera consistente en el mismo día de la semana.
4. Digestión in vitro
- Preparación de los anillos de inserción
- Cree un anillo de inserción esterilizado utilizando una junta tórica de silicona equipada con una membrana de diálisis lavada con ácido (Figura 1A).
NOTA: Prepare los prospectos con 1 día de antelación (es decir, el lunes día 12) del día del bioensayo y guárdelos en agua a 18 MΩ a 4 °C hasta que estén listos para su uso.
- El día del bioensayo (martes, día 13), retire los insertos del refrigerador, drene y reemplace el agua con HCl 0,5 M. Déjelo a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar durante al menos 1 h antes de usar.
NOTA: Este paso debe realizarse antes de retirar el MEM de las placas de cultivo. El lavado ácido de la membrana sirve para eliminar el posible Fe contaminante y esteriliza el anillo de inserción y la membrana.
- Drene el HCl 0,5 M de los insertos y enjuague con agua estéril de 18 MΩ. Almacene en agua estéril de 18 MΩ a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar hasta que esté listo para usar.
- Inserte un anillo en cada pocillo de las placas de 6 pocillos con celdas de Caco-2, creando así un sistema de dos cámaras. Regrese las placas con los insertos a la incubadora.
NOTA: Este paso debe realizarse justo después de agregar 1.0 mL de MEM fresco a cada pocillo (consulte el Paso 3.2.5.).
- Preparación de la solución de pepsina
- El día del experimento, prepare la solución de pepsina disolviendo 0,145 g de pepsina en 50 mL de HCl 0,1 M. Agite la solución suavemente en un agitador de plataforma durante 30 min a temperatura ambiente.
- Preparación de la solución de pancreatina-bilis
- El mismo día del experimento, prepare 0,1 M de NaHCO3 disolviendo 2,1 g de NaHCO3 en 250 mL de 18 MΩ de agua.
- Mezclar 0,35 g de pancreatina y 2,1 g de extracto biliar en 175 mL de NaHCO0,1 M 3.
- Una vez que la pancreatina y el extracto de bilis estén solubilizados, añadir 87,5 g de una resina de intercambio catiónico débil (ver la Tabla de Materiales) y mezclar agitando durante 30 min a temperatura ambiente.
- Vierta la lechada en una columna grande y recoja el eluido.
- Eluir la columna con 70 mL adicionales de NaHCO3 0,1 M, recogiendo este volumen en la solución de bilis de pancreatina.
NOTA: El propósito de la resina es eliminar el contaminante Fe que se encuentra comúnmente en los extractos de pancreatina-bilis.
- Iniciar la digestión in vitro.
- Pesar la muestra en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL (polipropileno), seguido de la adición de 10 mL de solución salina fisiológica a pH 2, que contiene 140 mM de NaCl y 5 mM de KCl.
- Iniciar el proceso de digestión gástrica añadiendo 0,5 mL de la solución de pepsina porcina preparada a la muestra e incubar en un agitador oscilante a temperatura baja y suave durante 1 h a 37 °C.
- Después de este período, inicie el proceso de digestión intestinal de cada muestra ajustando el pH a 5.5-6.0 con NaHCO3 1.0 M.
- Añadir 2,5 mL de la solución de pancreatina-bilis a cada tubo de muestra y ajustar el pH a 6,9-7,0 con NaHCO3 1,0 M.
- Una vez ajustado el pH, igualar el volumen de cada tubo con una solución de 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl (pH 6,7), midiendo el peso del tubo con un valor objetivo de 15 g
NOTA: Para algunos alimentos, es posible que sea necesario llevar el volumen total a 16 g o 17 g, dependiendo de la capacidad tampón de los alimentos.
- Transfiera 1,5 mL de cada digestión intestinal a la cámara superior (es decir, que contiene el anillo de inserción con la membrana de diálisis) de un pocillo correspondiente de la placa de cultivo de 6 pocillos que contiene las células Caco-2 (Figura 1B).
- Vuelva a colocar la tapa de la placa e incube a 37 °C (5% deCO2 en atmósfera de aire) en un agitador oscilante a 6 oscilaciones/min durante 2 h.
- Retire el anillo de inserción con el digesto y agregue 1 mL adicional de MEM (pH 7) a cada pocillo.
- Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora (37 °C; 5% deCO2 en atmósfera de aire) durante 22 h adicionales.
- Después de 22 h, retire el medio de cultivo celular y agregue 2,0 mL de 18 MΩ de agua a la monocapa celular.
NOTA: El agua lisará osmóticamente las células.
- Coseche el lisado celular completo en tubos de microcentrífuga de polipropileno estándar o similares para análisis posteriores de proteínas celulares y ferritina celular.
