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NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de bioseguridad de clase II con el soplador encendido y las luces apagadas.
1. Preparación de materiales
NOTA: Todos los materiales se enumeran en la Tabla de Materiales.
- Prepare el medio 1, el medio de centrifugación 2 y las soluciones fluorescentes de 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) amino]-D-glucosa (2-NBDG o FD-glucosa) de acuerdo con la Tabla 1 en un gabinete de bioseguridad de Clase II. Proteja la FD-glucosa de la luz durante todo el experimento apagando todas las luces debajo del capó.
- Utilice reactivos de cultivo celular listos para usar: tripsina-EDTA, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Dulbecco's Modified Eagle Medium (en adelante, DMEM sin glucosa) sin glucosa y sin rojo de fenol.
- Utilice 20 mL de tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA).
NOTA: En las siguientes secciones, se comparan la depleción extracelular y la captación intracelular de diferentes dosis de FD-glucosa en fibroblastos 3T3-L1 con y sin estimulación insulínica (Figura 1).
2. Cultivo y mantenimiento de células 3T3-L1
- Cultivo de fibroblastos de ratón 3T3-L1 mediante siembra de 1 x 106 células diluidas en 20 mL de medio 1 en dos placas de 96 pocillos. Placa de 100 μL de suspensión celular por pocillo, asegurando el mantenimiento de la homogeneidad de esta suspensión mediante la mezcla. Cultive las células durante 48 h en una incubadora a 37 °C (5% de CO2 y 95% de humedad) sin cambiar de medio hasta aproximadamente 70%-80% de confluencia.
- Mantener las células confluentes y en ayunas cultivándolas en el mismo medio durante 48 h. Variar el tiempo de incubación de 24-72 h dependiendo del estado catabólico de ayuno deseado.
3. Inanición de células 3T3-L1
- Decantar los medios de las celdas en las placas de 96 pocillos. Absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.
- Enjuague la placa de 96 pocillos con 100 μL de PBS por pocillo y absorba el líquido restante con toallas de papel estériles.
- Añadir 100 μL de DMEM sin glucosa por pocillo e incubar durante 40 min. Ajustar el tiempo de incubación en función del tipo de célula, los estímulos y el nivel de ayuno deseado.
NOTA: El tiempo de incubación puede requerir optimización dependiendo de la temporada.
4. Preparación de soluciones de FD-glucosa con diferentes concentraciones
NOTA: El experimento de la Figura 1 examina medios extracelulares e intercelulares con y sin estimulación con insulina.
- Use ocho réplicas (una fila en una placa de 96 pocillos) para cada condición de estimulación. Por lo tanto, prepare 1 mL para cada condición de estimulación (especificada en la Tabla 2 y a continuación).
- Utilice ocho condiciones de estimulación sin insulina: FD-glucosa de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL y 0 μg/mL (control sin FD-glucosa) en una placa de 96 pocillos.
- Utilice ocho condiciones de estimulación con insulina (10 μg/mL, concentración final): FD-glucosa de 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/mL y 0 μg/mL (control sin FD-glucosa) en otra placa de 96 pocillos.
- Para preparar las condiciones de estimulación, diluir 1 μL de 5 mg/mL de solución de trabajo de FD-glucosa (Tabla 1) en 999 μL de DMEM sin glucosa para obtener 1 mL de solución madre de trabajo (dilución 1:1000 o 5 μg/mL).
- Con esta solución madre de trabajo, prepare diluciones 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 y 1:100.000 de FD-glucosa para obtener 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL y 0,05 μg/mL (Tabla 2) en tubos de 2 mL inmediatamente antes de los experimentos en una cabina de bioseguridad sin luces.
- Repita el paso 4.4 y agregue 1 μL de insulina (10 mg/mL, concentración final) a cada una de las condiciones especificadas anteriormente.
NOTA: La concentración final de insulina en estas muestras es de 10 μg/mL = 1,7 nmol/mL. Para lograr la homogeneización, agregue insulina a los tubos antes de agregar otras soluciones.
5. Tratamiento de células 3T3-L1 hambrientas
- Después de 40 minutos de incubación, decantar el DMEM sin glucosa de cada pocillo en placas de 96 pocillos y absorber el líquido restante con toallas de papel estériles.
- Agregue 100 μL (por pocillo) de cada una de las diversas condiciones de tratamiento descritas anteriormente a los pocillos a lo largo de una columna, y 100 μL (por pocillo) de la misma condición de tratamiento a los pocillos a lo largo de la fila (ocho réplicas) en ambas placas de 96 pocillos. Etiquete las placas que utilizaron las condiciones con y sin insulina. Añada DMEM sin glucosa solo a los pocillos de control (n = 8).
- Incubar la placa durante 40 minutos en una incubadora de cultivo celular (37 °C, 5% de CO2 y 95% de humedad) en la oscuridad.
6. Mediciones extracelulares e intercelulares para células 3T3-L1 estimuladas
- Después de que las células hayan sido estimuladas durante 40 min, transfiera los medios de estimulación de ambas placas a nuevas placas de 96 pocillos manteniendo el mismo diseño experimental.
- Decanta cualquier solución restante de las placas originales estimuladas de 96 pocillos con células en toallas de papel estériles.
- Opcionalmente, lavar las celdas con PBS. Retire el PBS y decante cualquier resto de solución sobre toallas de papel estériles.
- Agregue 100 μL del tampón de lisis RIPA a cada pocillo. Opcionalmente, agregue un inhibidor de la proteasa al tampón RIPA para proteger las proteínas. Coloque los platos que contienen RIPA en una coctelera durante 30 min.
- Utilizando un lector de microplacas (Tabla de Materiales), mida la fluorescencia en longitudes de onda de excitación (Ex) y emisión (Em) de 485 y 535 nm, respectivamente, primero en el medio que contiene FD-glucosa extracelular y, a continuación, en la placa con células lisadas por RIPA al final de los 30 minutos de incubación (véase el paso 6.4).
Tabla 1: Preparación de medios de cultivo y soluciones de FD-glucosa.
| Solución/Medio | Componentes |
| Etanol: DMSO (1:1/v/v) | Etanol (200 μL) y DMSO (200 μL) en tubo de 1-1,5 mL; use etanol de grado de cultivo celular y DMSO |
| Medio 1 | DMEM (89 mL), penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) y suero de ternera (10%) (10 mL) en tubo estéril de 50 mL |
| Medio de centrifugación 2 | DMEM (89 mL), penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) y suero bovino (10%) (10 mL) en tubo estéril de 50 mL |
| Almacenamiento FD-solución de glucosa 5 mg/mL (14,5 mM) | FD glucosa (1 mg) y etanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) en tubo de 0,5 mL; almacenar a -80 °C, preferentemente bajo atmósfera de argón o nitrógeno |
| Solución de glucosa FD de trabajo: 5 μg/mL (14,5 mM) | Almacenamiento FD solución de glucosa 5 mg/mL (1 μL), DMEM sin glucosa (999 μL); preparar inmediatamente antes del experimento. |
Tabla 2: Preparación de soluciones de FD-glucosa con diferentes concentraciones para los experimentos mostrados en la Figura 1.
| dilución | control | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Concentración (μg/mL) | 0 | 2.5 | 1 | 0.5 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| DMEM sin glucosa (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glucosa 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
