Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
NOTA: Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de bioseguridad de clase II con el soplador encendido y las luces apagadas.
1. Preparación de materiales
NOTA: Todos los materiales se enumeran en la Tabla de Materiales.
- Prepare el medio 1, el medio de centrifugación 2 y las soluciones fluorescentes de 2-desoxi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-il) amino]-D-glucosa (2-NBDG o FD-glucosa) de acuerdo con la Tabla 1 en un gabinete de bioseguridad de Clase II. Proteja la FD-glucosa de la luz durante todo el experimento apagando todas las luces debajo del capó.
- Utilice reactivos de cultivo celular listos para usar: tripsina-EDTA, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y Dulbecco's Modified Eagle Medium (en adelante, DMEM sin glucosa) sin glucosa y sin rojo de fenol.
2. Medición ex vivo de la depleción extracelular de FD-glucosa en órganos
- Trate previamente a los ratones con compuestos que estimulan el metabolismo de la glucosa antes de la disección del órgano, de la siguiente manera.
- Utilice ratones machos Lepob de nueve semanas de edad (n = 11). Alimenta a todos los ratones con una dieta regular de comida antes del experimento.
- Asigne ratones al azar en tres grupos para inyecciones intraperitoneales (i.p.).
- Inyecte a los ratones del grupo control Lepob 0,1 mL de PBS estéril (n = 4).
- Inyectar a los ratones del grupo de insulina Lepob 0,1 mL de PBS estéril, que contiene 12 UI de insulina humana por gramo de peso corporal (PC) (n= 3).
- Inyecte a los ratones del grupo AAC2 Lepob 0,1 mL de PBS estéril, que contenga 0,1 nmol de AAC2 por gramo de peso corporal (PC) (n = 4).
- Después de 15 min, someter a los ratones a la inhalación de isoflurano al 5% y exangunar la sangre mediante punción cardíaca de los animales anestesiados.
- Diseccionar tejido adiposo blanco epidídimo visceral (200 mg), hígado (200 mg) y todo el cerebro de cada animal. Utilice una campana de bioseguridad de Clase II para la manipulación de tejidos.
- Prepare la solución de trabajo FD-glucosa (0,29 mM) en DMEM sin glucosa en una cabina de bioseguridad de Clase II sin luz.
- Mida la fluorescencia de la solución de trabajo de FD-glucosa (0,29 mM) a longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente, utilizando un lector de microplacas.
- Incube los tejidos/órganos recolectados en una placa de 6 pocillos que contenga PBS durante 1 min. Manipule cada tejido u órgano en un pocillo separado.
- Después de 1 minuto, coloque cada pañuelo sobre una toalla de papel estéril para absorber el PBS. Transfiera los tejidos/órganos a una placa separada de 6 pocillos que contenga 4.000 μL de DMEM sin glucosa e incube durante 2 minutos.
- Después de 2 minutos, retire y transfiera los tejidos a los pocillos de una placa de 6 pocillos que contiene 0,29 mM de solución de trabajo de FD-glucosa (1 mL/pocillo). Incubar las placas de 6 pocillos que contienen tejidos en una solución de trabajo de FD-glucosa a 37 °C (5% de CO2 y 95% de humedad).
- Recoja 100 μL de solución de trabajo de FD-glucosa de cada pocillo después de 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 y 120 minutos de incubación, para analizar la cinética de la depleción de glucosa por FD extracelular. Agitar antes y después de la recolección.
- Transfiera 100 μL de solución de trabajo de FD-glucosa a placas de 96 pocillos para medir la fluorescencia a longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente, utilizando un lector de microplacas.
- Normalice la fluorescencia al valor de 0 min (100%) para cada órgano de cada animal (Figura 1).
Tabla 1: Preparación de medios de cultivo y soluciones de FD-glucosa.
| Solución/Medio | Componentes |
| Etanol: DMSO (1:1/v/v) | Etanol (200 μL) y DMSO (200 μL) en tubo de 1-1,5 mL; use etanol de grado de cultivo celular y DMSO |
| Medio 1 | DMEM (89 mL), penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) y suero de ternera (10%) (10 mL) en tubo estéril de 50 mL |
| Medio de centrifugación 2 | DMEM (89 mL), penicilina/estreptomicina (1%) (1 mL) y suero bovino (10%) (10 mL) en tubo estéril de 50 mL |
| Almacenamiento FD-solución de glucosa 5 mg/mL (14,5 mM) | FD glucosa (1 mg) y etanol:DMSO (1:1/v/v) (200 μL) en tubo de 0,5 mL; almacenar a -80 °C, preferentemente bajo atmósfera de argón o nitrógeno |
| Solución de glucosa FD de trabajo: 5 μg/mL (14,5 mM) | Almacenamiento FD solución de glucosa 5 mg/mL (1 μL), DMEM sin glucosa (999 μL); preparar inmediatamente antes del experimento. |
