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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de conformidad con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local
1. Medición de la contracción (ejemplo de SMCs)
- Prepare una matriz ECIS 96w10e (consulte la Figura 1A para obtener una imagen representativa de la matriz con electrodos ampliados y celdas sembradas en los electrodos).
NOTA: Realice los siguientes pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos estéril.
- Cubra una matriz estéril de 96w10e con 200 μL de L-cisteína de 10 mM por pocillo durante 30 min a temperatura ambiente.
- Lave el plato dos veces con agua estéril. Deje que la placa se seque durante la noche en la campana de cultivo de tejidos con la tapa ligeramente abierta.
NOTA: El recubrimiento de la placa con L-cisteína solo es necesario cuando se usa la placa por primera vez.
- Al día siguiente, esterilice la placa y la tapa con rayos UV durante 30 min. Gire la tapa hacia arriba para que el interior quede esterilizado. Una vez que la placa esté esterilizada, no abra la placa fuera de la campana de flujo.
- Células de siembra en la matriz ECIS
- Precaliente la solución de gelatina estéril al 1% en el baño de agua durante 30 min.
NOTA: La solución se almacena en el refrigerador y puede solidificarse, lo que dificulta la pipeta.
- A continuación, recubra los pocillos con 100 μL de la solución de gelatina al 1 % por pocillo e incube la placa a 37 °C durante al menos 1 h.
- Aspira la gelatina de los pocillos.
- Cuente las células utilizando un contador de células automatizado y siembre las SMC por triplicado a una densidad de siembra de 30.000 células/pocillo en 200 μL de medio SMC.
- Coloque la placa con los SMC en el soporte ECIS de 96 pocillos en la incubadora de cultivos celulares. Haga doble clic en el software ECIS Applied Biophysics para abrir el programa y pulse el botón Configuración.
- Verifique si todos los electrodos tienen contacto con el soporte (verde; rojo si no hay conexión) en el panel inferior izquierdo etiquetado como Configuración del pocillo. Si los electrodos no están conectados correctamente, ajuste la placa en el soporte antes de comenzar la medición.
- Seleccione el tipo de placa (matriz de 96 pocillos) en el mismo panel haciendo clic en Tipo de matriz.
- En la configuración de recopilación de datos del panel superior derecho, haga clic en frecuencia única y cambie el valor de impedancia a 4000 Hz y el intervalo a 8 s.
- Haga clic en el botón Iniciar para iniciar las mediciones. Espere a que se abra un nuevo panel, donde se puede guardar el archivo ECIS.
- Permita que las celdas se adhieran y establezcan una monocapa durante 48 h.
NOTA: La fijación y la distribución de las celdas en los electrodos generan un valor de resistencia de referencia (Figura 1B).
- Estimulación de las células para inducir la contracción
- Inducir la contracción de SMC estimulando las células con 10 μg/mL del ionóforo de calcio, ionomicina.
NOTA: La ionomicina inducirá la afluencia de Ca2+ extracelular, activando la cascada contráctil; consulte la Figura 2A para obtener imágenes representativas de células contraídas y no estimuladas.
- Diluir 1 mg de ionomicina en polvo en 100 μL de dimetilsulfóxido para formar una solución madre de 10 mg/mL, y almacenar 10 μL de alícuotas a -20 °C. Antes de usar, diluya la solución de ionomicina 1:10 en el medio SMC para preparar la solución de trabajo que se agregará a las células.
- Realice la estimulación celular mientras la matriz aún está en el soporte de la matriz dentro de la incubadora de cultivo celular y los electrodos están conectados al sistema.
- Para estimular las células, retire la tapa y colóquela sobre una superficie estéril dentro de la incubadora. Prepare dos pipetas, ajustadas a 2 μL y 150 μL.
- Antes de comenzar la estimulación, presione Marcar en el software y coloque un comentario.
NOTA: Esto hará que sea más fácil encontrar el momento exacto de la estimulación al analizar los datos.
- Pipetear 2 μL de la solución de trabajo de ionomicina en cada pocillo lo más rápido posible. Una vez que se hayan estimulado todas las células, mezcle el medio en los pocillos con la segunda pipeta.
NOTA: Debido a los efectos rápidos, no es necesario cambiar las puntas entre diferentes líneas celulares y condiciones. Trabaje rápidamente mientras estimula y mezcla porque la ionomicina tiene un efecto agudo. Al estimular un plato lleno, estimule un máximo de 3 columnas a la vez. Después de cada estimulación, espere al menos 30 minutos hasta la siguiente estimulación para que las células se recuperen del cambio de temperatura y CO2 causado por la apertura de la puerta de la incubadora.
- Inmediatamente después de que se realice la estimulación, presione Marcar nuevamente para agregar un comentario que indique que la estimulación está terminada.
- Terminando el experimento de estimulación
- Registre los valores de impedancia durante aproximadamente 5 minutos después de la estimulación con ionomicina. Finalice la grabación pulsando Finalizar.
