El ensayo de filamento de actina deslizante: un ensayo de motilidad in vitro para estudiar la translocación de filamentos de actina en miosinas inmovilizadas

Resumen

Fuente: Tripathi, A., et al. Adaptaciones específicas de miosina de los ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, realizamos un ensayo de motilidad in vitro para analizar las interacciones actina-miosina. El movimiento de deslizamiento de los filamentos de actina sobre las moléculas de miosina inmovilizadas se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

1. Ensayo de filamento de actina deslizante

1. Preparación del cubreobjetos
   1. Prepara una solución de nitrocelulosa al 1% en acetato de amilo.
   2. Obtenga una placa de cultivo de tejidos (150 x 25 mm) y agregue un papel de filtro circular (125 mm de diámetro) al fondo de la placa.
   3. Cargue ocho cubreobjetos cuadrados n.º 1,5 de espesor y 22 mm en una rejilla y lávelos con aproximadamente 2-5 mL de etanol de 200 grados, seguidos de 2-5 mL de agua destilada (dH₂O). Repita este paso de lavado, terminando con agua. A continuación, seque completamente los cubreobjetos con una línea de aire filtrada o una línea N₂.
   4. Tome un cubreobjetos y pipetee lentamente 10 μL de la solución de nitrocelulosa al 1% a lo largo de un borde del portaobjetos. A continuación, con un movimiento suave, extiéndalo por el resto del cubreobjetos con el lado de una punta de pipeta lisa de 200 μL. Coloque este cubreobjetos en la placa de cultivo de tejidos con la nitrocelulosa hacia arriba. Repita el procedimiento para los cubreobjetos restantes y déjelos secar mientras prepara los reactivos restantes, y utilícelos dentro de las 24 horas posteriores al recubrimiento.
2. Preparación de la cámara
   1. Limpie un portaobjetos de microscopio con un papel para lentes ópticos para limpiar los residuos grandes. Corta dos trozos de cinta adhesiva de doble cara, de aproximadamente 2 cm de longitud.
   2. Coloque una pieza a lo largo del centro del borde largo del portaobjetos del microscopio. Asegúrese de que el borde de la cinta esté alineado con el borde de la diapositiva. Coloque el segundo trozo de cinta aproximadamente 2 mm por debajo del primer trozo de cinta adhesiva, de modo que los dos queden paralelos y alineados. Esto crea una cámara de flujo que puede contener aproximadamente 10 μL de solución (ver Figura 1).
   3. Tome uno de los cubreobjetos recubiertos de nitrocelulosa de la Parte 1. Pegue con cuidado el cubreobjetos sobre la cinta de manera que el lado recubierto con nitrocelulosa haga contacto directo con la cinta (consulte la Figura 1). Con la ayuda de una punta de pipeta, presione suavemente la interfaz de la cinta deslizante para asegurarse de que el cubreobjetos se haya adherido correctamente al portaobjetos. Corta el exceso de cinta que cuelga sobre el borde del portaobjetos con una cuchilla de afeitar.
3. Preparación de actina
   1. Produzca 20 μM de F-actina polimerizando la actina globular (G-actina) en tampón de polimerización (50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 25 mM MOPS (pH 7,0) a 4 °C durante la noche.
   2. Diluir F-actina a 5 μM en tampón de motilidad (20 mM MOPS, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM EGTA, 1 mM DTT (pH 7,4)). Etiqueta con al menos 1,2 veces el exceso molar de rodamina-faloidina. Dejar (cubierto con papel de aluminio) durante al menos 2 h sobre hielo. Esto se puede usar hasta por 1-2 meses y almacenar en hielo.
4. Realización del ensayo de filamento de actina deslizante de miosina 5a
   NOTA: En esta sección, se proporcionan los detalles del ensayo de deslizamiento de miosina 5a (HMM).
   1. Prepare las soluciones para la miosina 5a descritas en la Tabla 1 y manténgalas en hielo.
   2. Fluya en 10 μL de miosina 5a (50-100 nM) a través de la cámara de flujo y espere 1 min.
   3. Flujo en 10 μL de la BSA de 1 mg/mL en 50 mM MB con 1 mM DTT (tampón "bajo en sal"). Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Utilice la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal colocando suavemente la esquina del papel en la salida de la cámara de flujo.
   4. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM DTT. Repite este lavado dos veces más.
   5. Flujo en 10 μL de la solución de actina negra (5 μM de F-actina, 1 μM de calmodulina y 1 mM de ATP en 50 mM MB con 1 mM de DTT) para eliminar las "cabezas muertas".
      1. Pipetear la solución con una jeringa de 1 mL y una aguja de 27 G para cortar los filamentos de actina antes de introducir la solución en la cámara. Repita este paso dos veces más y espere 1 minuto después de la tercera vez. Aproximadamente 20 eventos de pipeteo son suficientes.
      2. Para realizar el espín de "cabeza muerta", agregue una cantidad estequiométrica de F-actina a la miosina en presencia de 1 mM de ATP y 1 mM de MgCl₂ a una concentración de sal de 500 mM. A continuación, ultracentrífuga a 480.000 x g durante 15 min a 4 °C. La miosina muerta estará en la bolita.
   6. Flujo en 50 μL de 50 mM MB con 1 mM de TDT y 1 mM de ATP para agotar la cámara de filamentos de actina libre.
   7. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM DTT. Repita este lavado dos veces más para agotar la cámara de cualquier ATP.
   8. Fluya en 10 μL de 20 nM de solución de actina de rodamina (Rh-Actina) que contenga 1 mM de DTT en 50 mM MB y espere 1 min para permitir la unión rigurosa de los filamentos de actina a la miosina 5a adherida a la superficie del cubreobjetos.
   9. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM DTT para lavar los filamentos de Rh-Actina que no están unidos a la superficie. Repite este lavado dos veces más.
   10. Flujo en 30 μL de tampón final.
   11. Registre imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 561 nm para visualizar la Rh-Actina. Un tiempo de exposición adecuado es de 200 ms a una potencia láser de 1,4 mW para una duración total de adquisición de 0,5-1 min.
       NOTA: Asegúrese de que la tasa de adquisición se escale adecuadamente a la velocidad de los filamentos en movimiento. Una consideración importante antes de recopilar datos para su uso con programas de seguimiento es la velocidad de fotogramas de adquisición. Los movimientos de subpíxeles entre fotogramas darán lugar a una sobreestimación de la velocidad, y se requieren movimientos de varios cientos de nanómetros para obtener valores precisos. Una tasa de adquisición óptima presenta el deslizamiento de actina durante al menos una distancia de un píxel entre fotogramas. En el caso del microscopio TIRF utilizado para la obtención de imágenes aquí, este umbral se traduce en 130 nm; Por lo tanto, una miosina que se espera que viaje 1 μm/s debe ser visualizada a una velocidad de 5 fotogramas/s (intervalo de 0,2 s) para lograr 200 nm de movimiento, mientras que una miosina que se espera que viaje 10 nm/s requiere 0,05 fotogramas/s (intervalos de 20 s). Por lo tanto, los datos se pueden reducir en esta etapa si es necesario.

Tabla 1: Tampones utilizados en el ensayo de deslizamiento

Nombre del búfer	Composición (M5a)	Composición (NM2b)	Escalón(es) utilizado(s) (M5a/NM2b)	Comentarios
4X Búfer de Motilidad (4X MB)	MOPS de 80 mM, pH 7,2	MOPS de 80 mM, pH 7,2		Aspirar filtrar y almacenar a 4°C
	20 mM MgCl2	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA	0,4 mM EGTA
	pH 7.4	pH 7.4
50 mM Tampón de motilidad salina (50 mM MB)	25% v/v 4X MB	25% v/v 4X MB		Aspirar filtrar y almacenar a 4°C
	50 mM KCl	50 mM de NaCl
	Sube el volumen con dH2O	Sube el volumen con dH2O
500 mM Tampón de motilidad salina (500 mM MB)	N/A	25% v/v 4X MB		Aspirar filtrar y almacenar a 4°C
		500 mM de NaCl
		Sube el volumen con dH2O
Miosina	0,05-0,1 μM de miosina	0,2 μM de miosina	4.2	Mantener en hielo.
	TDT de 1 mM	TDT de 1 mM
	Diluir en 50 mM MB	Diluir en 500 mM MB
1 mg/mL Albúmina sérica bovina (BSA)	1 mg/mL de BSA	1 mg/mL de BSA	4.3	Mantener en hielo.
	Diluir en 50 mM MB	Diluir en 500 mM MB
	TDT de 1 mM	TDT de 1 mM
5 μM F-actina sin marcar en 50 mM MB (actina negra)	5 μM de F-actina sin marcar	5 μM de F-actina sin marcar	4.5	Mantener en hielo. Cargue la actina pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces, o usando una jeringa.
	1 μM de calmodulina (CaM)	1 mM de ATP
	1 mM de ATP	0,2 mM de CaCl2
	Diluir en 50 mM MB	1 μM CaM
		Quinasa de cadena ligera de miosina de 1–10 nM (MLCK)
		Diluir en 50 mM MB
MB con 1 mM de TDT y 1 mM de ATP	TDT de 1 mM	TDT de 1 mM	4.6	Mantener en hielo.
	1 mM de ATP	1 mM de ATP
	Diluir en 50 mM MB	Diluir en 50 mM MB
MB con TDT	TDT de 1 mM	TDT de 1 mM	4.4, 4.7, 4.9	Mantener en hielo.
	Diluir en 50 mM MB	Diluir en 50 mM MB
20 nM Rodamina-Faloidina F-actina (Rh-Actina)	20 nM Rodamina-faloidina F-actina	20 nM Rodamina-faloidina F-actina	4.8	Mantener en hielo. No haga vórtice.
	TDT de 1 mM	TDT de 1 mM
	Diluir en 50 mM MB	Diluir en 50 mM MB
Búfer final	50 mM KCl	0,7% de metilcelulosa (opcional)	4.10	Agregue la glucosa, la glucosa oxidasa y la catalasa inmediatamente antes de realizar el experimento. Mantener en hielo.
	MOPS de 20 mM, pH 7,2	50 mM de NaCl
	5 mM MgCl2	MOPS de 20 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA	5 mM MgCl2
	1 mM de ATP	0,1 mM EGTA
	TDT de 50 mM	1 mM de ATP
	1 μM de calmodulina	TDT de 50 mM
	2,5 mg/mL de glucosa	1–10 nM MLCK
	100 μg/mL de glucosa oxidasa	0,2 mM de CaCl2
	40 μg/mL catalasa	1 μM de calmodulina
		2,5 mg/mL de glucosa
		100 μg/mL de glucosa oxidasa
		40 μg/mL catalasa

Resultados

Figura 1: Preparación de cámaras de celda de flujo funcionalizadas. (A) Comience con un portaobjetos de microscopio limpio, dos pedazos de cinta adhesiva de doble cara cortados a aproximadamente 2 cm y un cubreobjetos funcionalizado. (B) Agregue la cinta al centro del portaobjetos del microscopio. (C) Fije el cubreobjetos a la cinta con el recubrimie...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Acetato de amilo	Industrias de investigación de Ladd	10825
ATP	Millipore Sigma	A7699
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	5470
calmodulina		PMID: 2985564
catalasa	Millipore Sigma	C40
Papel de filtro circular - Ensayo deslizante	Millipore Sigma	WHA1001125
Estante de cubreobjetos	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Coverslips: Ensayo de filamento de acción deslizante	VWR Internacional	48366-227
DL-Ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Cinta adhesiva de doble cara	Depósito de oficinas	909955
EGTA	Millipore Sigma	E4378
etanol	Fischer Científico	A4094
G-actina		PMID: 4254541	El stock de G-actina se puede almacenar a 200 μM en N2 líquido.
glucosa	Millipore Sigma	G8270
Glucosa oxidasa	Millipore Sigma	G2133
Kcl	Fischer Científico	P217-500
Puntas de pipeta de orificio grande	Fischer Científico	02-707-134
Metilcelulosa	Millipore Sigma	M0512
Portaobjetos de microscopio	Fischer Científico	Teléfono 12-553-10
Mops	Fischer Científico	BP308-100
nitrocelulosa	Industrias de investigación de Ladd	10800
Afeitar	Depósito de oficinas	397492
Rodamina-Faloidina	ThermoFisher Scientific	R415	El caldo se puede diluir en metanol al 100% hasta una concentración final de 200 μM.
Placa de cultivo de tejidos - Ensayo deslizante	Corning	353025	Cada placa de cultivo de tejidos puede contener aproximadamente nueve cubreobjetos.
Puntas de pipeta de 200 μL de lados lisos	Thomas Científico	1158U38
equipo
centrífuga	ThermoFisher Scientific	75006590
microscopio	Nikon	Modelo: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con objetivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
Cámara microscópica	Andor	Modelo: cámara iXon DU888 EMCCD (formato de sensor de 1024 x 1024)
Caja de control ambiental para microscopio	Tokai HIT	Thermobox personalizado
Unidad láser de microscopio	Nikon	Unidad de cuatro láseres LU-n4 con láseres de estado sólido para 405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm
Ultracentrífuga de sobremesa Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315