Ensayo de motilidad invertida: una técnica in vitro para visualizar el movimiento de la miosina en filamentos de actina inmovilizados

Resumen

Fuente: Tripathi, A., et al. Adaptaciones específicas de miosina de los ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, realizamos un ensayo de motilidad in vitro para analizar las interacciones actina-miosina. El movimiento de deslizamiento de los filamentos de actina sobre las moléculas de miosina inmovilizadas se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

1. Purificación de proteínas

1. Lisis celular y extracción de proteínas
   1. Prepare un búfer de extracción de 1,5x basado en la Tabla 1. Filtrar y almacenar a 4 °C.
   2. Comience a descongelar los gránulos de células en hielo. Mientras se descongelan los gránulos, complemente 100 mL de tampón de extracción con 1,2 mM de ditiotreitol (DTT), 5 μg/mL de leupeptina, 0,5 μM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y dos comprimidos de inhibidores de la proteasa. Mantener en hielo.
   3. Una vez que el pellet se haya descongelado, agregue 1 mL del tampón de extracción suplementado por cada 10 mL de cultivo celular. Por ejemplo, si los gránulos de células se formaron a partir de 500 mL de cultivo celular, agregue 50 mL de tampón de extracción suplementado al gránulo.
   4. Sonica los gránulos de la célula mientras los mantienes en hielo. Para cada perdigón, utilice las siguientes condiciones: 5 s ON, 5 s OFF, duración de 5 min, potencia 4-5.
   5. Recoja todo el lisado homogeneizado en un vaso de precipitados y añada ATP (solución madre de 0,1 M; pH 7,0) de modo que la concentración final de ATP sea de 1 mM. Revuelva durante 15 minutos en una cámara fría. El ATP disocia la miosina activa de la actina, lo que permite separarla en el siguiente paso de centrifugación. Por lo tanto, es esencial pasar al siguiente paso de inmediato para minimizar la posibilidad de agotamiento de ATP y volver a unirse a la actina.
   6. Centrifugar los lisados a 48.000 x g durante 1 h a 4 °C. Mientras esto ocurre, comience a lavar de 1 a 5 ml de una suspensión al 50% de resina de afinidad Anti-FLAG (para un pellet formado por 1 litro de celdas) con 100 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, para 5 mL de resina, lave 10 mL de una suspensión al 50%. En el paso de lavado final, vuelva a suspender la resina con 1-5 ml de PBS con suficiente volumen para crear una suspensión del 50%.
   7. Después de la centrifugación del lisado, combine el sobrenadante con la lechada de resina lavada y mece suavemente en la cámara frigorífica durante 1-4 h. Mientras espera, haga los amortiguadores descritos en la Tabla 1 y manténgalos en hielo.
2. Preparación de la purificación por afinidad con FLAG
   1. Centrifugar la solución en el paso 1.7 a 500 x g durante 5 min a 4 °C. La resina se empaquetará en la parte inferior del tubo. Sin alterar la resina, retire el sobrenadante.
   2. Vuelva a suspender la resina en 50 mL de tampón A como se detalla en la Tabla 1 y centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Sin alterar la resina, retire el sobrenadante.
   3. Vuelva a suspender la resina en 50 mL de tampón B como se detalla en la Tabla 1 y centrifugue a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso una vez más y vuelva a suspender la resina en 20 mL de tampón B. A continuación, mezcle bien la resina y el tampón invirtiendo suavemente el tubo con la mano unas 10 veces.
3. Elución y concentración de proteínas
   1. Prepare 30 mL de tampón de elución como se describe en la Tabla 1 y déjelo enfriar en hielo.
   2. Instale la columna de elución en una cámara frigorífica. Vierta suavemente la lechada de resina en la columna. Lave la columna con 1-2 volúmenes de columna de Buffer B a medida que la resina se empaqueta en la parte inferior, asegurándose de que la resina no se seque.
   3. Fluya 1 mL del tampón de elución a través de la resina y recoja el flujo en un tubo de 1,5 mL. Repita de modo que se recojan fracciones de 12 1 mL.
   4. En este punto, realice una prueba de Bradford cruda sobre las fracciones para determinar cualitativamente qué fracciones son las más concentradas. En una fila de una placa de 96 pocillos, pipetee 60 μL 1x reactivo Bradford. A medida que se recolectan las fracciones, mezcle 20 μL de cada fracción por pocillo. Una coloración azul más oscura indica las fracciones más concentradas.
   5. En un tubo de 50 ml, recoja la proteína restante pipeteando suavemente el tampón de elución restante a través de la columna, para liberar cualquier miosina restante unida a la resina en el flujo de la columna. Este flujo se concentrará en el siguiente paso. Asegúrese de que la resina se regenere para su reutilización y se almacene de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   6. Agrupe las tres fracciones más concentradas y concentre aún más el flujo en el tubo de 50 mL, así como las fracciones restantes de 1 mL utilizando un tubo concentrador de 100.000 MWCO. Cargue la muestra agrupada en el tubo concentrador y centrifugue a 750 x g durante 15 min a 4 °C y repita hasta que toda la proteína eluida se haya concentrado a un volumen final de aproximadamente 0,5-1 mL.
      nota: Este tamaño de poro permite la retención de las moléculas de miosina, que tienen masas varias veces superiores al límite de peso molecular. Las cadenas ligeras permanecen fuertemente unidas a los dominios motores durante este curso de tiempo de concentración, como se verifica mediante la realización de electroforesis en gel SDS-PAGE en el producto final.
4. Diálisis y congelación instantánea
   1. Prepare 2 L de tampón de diálisis, como se describe en la Tabla 1. Cargue la muestra en una bolsa o cámara de diálisis y dialice durante la noche en la cámara frigorífica.
      nota: En el caso de M5a-HMM, después de la diálisis nocturna, la proteína será lo suficientemente pura para su uso en ensayos posteriores. Si es necesario, se pueden realizar otros pasos de purificación, como la filtración en gel o la cromatografía de intercambio iónico.
5. Recuperación de la miosina después de la diálisis
   1. En el caso de M5a-HMM, recoja cuidadosamente toda la muestra de la cámara de diálisis y centrifuga a 4 °C durante 15 minutos a 49.000 x g en caso de que haya agregados no deseados. Toma el sobrenadante.
6. Determinación de la concentración y congelación instantánea
   1. Para determinar la concentración del producto, mida la absorbancia con un espectrofotómetro en longitudes de onda de 260, 280, 290 y 320 nm. Calcule la concentración en mg/mL (c_mg/mL) con la Ecuación 1, donde A₂₈₀ representa la absorción a 280 nm y A₃₂₀ representa la absorción a 320 nm. La concentración resultante en mg/mL se puede convertir en μM de moléculas de miosina con la Ecuación 2, donde M es el peso molecular de toda la proteína (incluidas las cadenas pesadas, las cadenas ligeras, los fluoróforos y todas las etiquetas)
      c_mg/mL = (A₂₈₀ - A₃₂₀) / ε (1)
      μM moléculas = 1000c_mg/mL/M (2)
      nota: Si es necesaria una dilución, debe hacerse en un tampón de alta fuerza iónica. El coeficiente de extinción (ε) se puede determinar importando la secuencia de aminoácidos de la proteína a un programa como ExPASy. El rendimiento típico del M5a-HMM es de aproximadamente 0,5-1 mL de 1-5 mg/mL de proteína. El coeficiente de extinción para el M5a-HMM utilizado en este trabajo fue de 0,671.
   2. Almacene la miosina purificada de una de las dos maneras. Alicuente entre 10 y 20 μL en un tubo de pared delgada, como un tubo de reacción en cadena de polimerización, y deje caer el tubo en un recipiente de nitrógeno líquido para la congelación instantánea. Alternativamente, pipetee directamente entre 20-25 μL de miosina en nitrógeno líquido y almacene las perlas congeladas de proteína en tubos criogénicos estériles. En cualquier caso, los tubos resultantes pueden almacenarse a -80 °C o en nitrógeno líquido para su uso futuro.
      nota: Dado que el ensayo de motilidad descrito a continuación requiere cantidades muy pequeñas de proteína, el almacenamiento en pequeñas alícuotas, como se describe, es económico.

2. Ensayo TIRF de molécula única

1. Preparación del cubreobjetos
   1. Divida el polvo madre en 10 mg de alícuotas (en tubos de 1,5 ml) de metoxi-peg-silano (mPEG) y 10 mg de alícuotas de biotina-peg-silano (bPEG). Almacenar a -20 °C en un recipiente sellado y sin humedad y utilizar durante 6 meses.
   2. Cargue ocho cubreobjetos cuadrados de 22 mm de espesor n.º 1,5H (alta precisión) en una rejilla y lávelos con 2-5 mL de etanol de 200 grados seguidos de 2-5 mL de agua destilada. Repita este paso de lavado, terminando con agua. A continuación, seque completamente los cubreobjetos con una línea de aire o N₂ y limpie con plasma con argón durante 3 min.
   3. Coloque los cubreobjetos limpios en papel de filtro (90 mm) en una placa de cultivo de tejidos (100 x 20 mm) e incube en un horno a 70 °C mientras realiza los siguientes pasos><. NOTA: La limpieza con plasma se puede reemplazar con otros métodos de limpieza químicos.
   4. Prepare una solución de etanol al 80% con dH₂O y ajuste el pH a 2.0 usando HCl. Agregue 1 mL de esto a una alícuota de 10 mg de mPEG y 1 mL a una alícuota de 10 mg de bPEG. Vórtice para disolver, que no debería tardar más de 30 s.
   5. Tome 100 μL de la solución de bPEG y agregue 900 μL de etanol al 80% (pH 2.0). Esta solución es 1 mg/mL de bPEG. Luego, haga una solución de ambos PEG de la siguiente manera, mezclando bien.
      1. 200 μL de 10 mg/mL mPEG (concentración final: 2 mg/mL).
      2. 10 μL de 1 mg/mL de bPEG (concentración final: 10 μg/mL).
      3. 790 μL de la solución de etanol al 80% (pH 2.0).
   6. Saca los cubreobjetos del horno. Dispense con cuidado 100 μL de la solución de PEG en el centro de cada cubreobjetos, asegurándose de que solo la superficie superior esté mojada. Luego, vuelva a colocar las barbolas en el horno e incube durante 20 a 30 minutos.
   7. Cuando los cubreobjetos comiencen a tener una apariencia agujereada, con pequeños círculos aparentes en la superficie, retírelos del horno.
   8. Lave cada cubreobjetos con etanol 100%, séquelo con una línea de aire y vuelva a colocarlo en el horno. Incube solo durante el tiempo requerido para crear cámaras en el paso 2.
2. Preparación de la cámara
   1. Limpie un portaobjetos de microscopio para usarlo en la fabricación de la cámara. Corta dos trozos de cinta adhesiva de doble cara, de aproximadamente 2 cm de longitud.
   2. Coloque una pieza a lo largo del centro del borde largo del portaobjetos del microscopio. Asegúrese de que el borde de la cinta esté alineado con el borde de la diapositiva. Coloque el segundo trozo de cinta aproximadamente 2 mm por debajo del primer trozo de cinta adhesiva, de modo que los dos queden paralelos y alineados.
   3. Tome uno de los cubreobjetos funcionalizados del horno (creado en 2.1). Pegue con cuidado el cubreobjetos en la cinta de modo que el lado recubierto con PEG quede boca abajo y haga contacto directo con la cinta, como se muestra en la Figura 1. Con la ayuda de una punta de pipeta, presione suavemente la interfaz de la cinta deslizante para asegurarse de que el cubreobjetos se haya adherido correctamente al portaobjetos.
   4. Corta el exceso de cinta adhesiva que cuelga sobre el portaobjetos con una cuchilla de afeitar. Estas cámaras pueden utilizarse inmediatamente o colocarse por pares en un tubo de 50 ml y almacenarse en un congelador de -80 °C para su uso futuro. Es importante almacenar inmediatamente o la superficie se degradará.
3. Realización del ensayo de microscopía TIRF de miosina 5a
   1. Prepare las soluciones para el ensayo de motilidad invertida de miosina 5a descrito en la Tabla 2 y manténgalas en hielo.
   2. Lavar la cámara con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM DTT.
   3. Flujo en 10 μL de 1 mg/mL BSA en 50 mM MB con 1 mM DTT. Repita este lavado dos veces más y espere 1 minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal.
   4. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM DTT. Repite este lavado dos veces más.
   5. Fluya en 10 μL de la solución de NeutrAvidin en 50 mM MB con 1 mM DTT y espere 1 min.
   6. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM DTT. Repite este lavado dos veces más.
   7. Fluya 10 μL de actina rodamina biotinilada (bRh-Actina) que contenga 1 mM de DTT en 50 mM MB y espere 1 min. Para este paso, utilice una punta de pipeta de gran diámetro y evite pipetear hacia arriba y hacia abajo para minimizar el cizallamiento de los filamentos de actina fluorescentes y garantizar que los filamentos de actina largos se puedan adherir a la superficie (20-30 μm o más). Una alternativa eficaz es cortar el cono de una punta de pipeta estándar (con una abertura de ≈1-1,5 mm).
   8. Lavar con 10 μL de 50 mM MB con 1 mM DTT. Repite este lavado dos veces más.
   9. Fluya en 30 μL de tampón final con 10 nM de miosina 5a agregados, luego cargue inmediatamente en el microscopio TIRF y registre después de encontrar el enfoque óptimo para la modalidad de imagen TIRF. Los tiempos de exposición entre 100 y 200 ms son apropiados a una potencia láser de 1,4 mW para la actina y la miosina marcada con GFP. Un tiempo de adquisición adecuado para el análisis de velocidad es de 3 min.

Tabla 1: Tampones utilizados en la purificación de proteínas.

Nombre del búfer	composición	Paso(s) utilizado(s)	Comentarios
M5a Búfer de extracción	0,3 M de NaCl	1.1	Mantener en hielo.
	MOPS de 15 mM, pH 7,2
	15 mM MgCl2
	EGTA de 1,5 mM
	4,5 mM NaN3
Búfer A	0,5 M de NaCl	2.2	Mantener en hielo.
	MOPAS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	1 mM de ATP
	TDT de 1 mM
	5 mM MgCl2
Búfer B	0,5 M de NaCl	2.3	Mantener en hielo.
	MOPAS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	TDT de 1 mM
Tampón de elución	0,5 M de NaCl	3.1	Mantener en hielo.
	0,5 mg/mL de péptido FLAG
	MOPAS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	3 mM NaN3
	pH 7.2
M5a Tampón de diálisis	500 mM KCl	4.1	Usa cold dH2O para llevar al volumen.
	10 mM MgCl2
	MOPAS de 10 mM, pH 7,2
	0,1 mM EGTA
	TDT de 1 mM

Tabla 2: Tampones utilizados en el ensayo TIRF.

Nombre del búfer	composición	Paso(s) utilizado(s)	Comentarios
4X Búfer de Motilidad (4X MB)	MOPS de 80 mM, pH 7,2		Aspirar filtrar y almacenar a 4°C
	20 mM MgCl2
	0,4 mM EGTA
	pH 7.4
50 mM Tampón de motilidad de sal (50 mM MB)	25% v/v 4X MB		Aspirar filtrar y almacenar a 4°C
	50 mM KCl
	Subir al volumen con dH2O
Tampón de motilidad salina de 150 mM (150 mM MB)			Filtrar al vacío y almacenar a 4 °C
miosina		Ver receta de "Tampón final"	Mantener en hielo.
2 mg/mL NeutrAvidin	2 mg/mL de NeutrAvidin	3.5	Mantener en hielo.
	TDT de 1 mM
	Diluir en 50 mM MB
1 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA)	1 mg/mL de BSA	3.3	Mantener en hielo.
	TDT de 1 mM
	Diluir en 50 mM MB
200 nM rodamina-faloidina F-actina biotinilada (bRh-actina)	200 nM de rodamina-faloidina F-actina biotinilada	3.7	Evite el cizallamiento al no vorticar ni pipetear hacia arriba y hacia abajo. Para mezclar, invierta suavemente.
	TDT de 1 mM
	Diluir en 50 mM MB
MB con TDT	TDT de 50 mM	3.2, 3.4, 3.6, 3.8	Mantener en hielo.
	Diluir en 50 mM MB
Búfer final	50 mM KCl	3.9	Agregue la glucosa, la glucosa oxidasa y la catalasa inmediatamente antes de realizar el experimento. Mantener en hielo.
	MOPS de 20 mM, pH 7,2
	5 mM MgCl2
	0,1 mM EGTA
	1 mM de ATP
	TDT de 50 mM
	1 μM de calmodulina
	2,5 mg/mL de glucosa
	100 μg/mL de glucosa oxidasa
	40 μg/mL catalasa
	10 nM de miosina

Resultados

Figura 1: Preparación de cámaras de celda de flujo funcionalizadas.(A) Comience con un portaobjetos de microscopio limpio, dos pedazos de cinta adhesiva de doble cara cortados a aproximadamente 2 cm y un cubreobjetos funcionalizado. (B) Agregue la cinta al centro del portaobjetos del microscopio. (C) Fije el cubreobjetos a la cinta con el recubrimien...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de 2 M de MgCl2	VWR	10128-298
Solución de NaCl de 5 M	KD Medicina	RGE-3270
ácido acético	ThermoFisher Scientific	984303
Gel de afinidad Anti-FLAG M2	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	A7699
G-actina biotinilada	Citoesqueleto, Inc.	AB07
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	5470
bPEG-silano	Laysan Bio, Inc	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Concentrado de reactivo Bradford	Bio-Rad	5000006
calmodulina		PMID: 2985564
catalasa	Millipore Sigma	C40
Línea celular (SF9) en SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Papel de filtro circular - Ensayo invertido	Millipore Sigma	WHA1001090
Comprimidos completos de inhibidores de la proteasa sin EDTA	Millipore Sigma	5056489001	Debe almacenarse a 4 °C. Los comprimidos se pueden utilizar directamente o se pueden reconstituir como una solución madre 25x disolviendo 1 comprimido en 2 mL de agua destilada. La solución resultante puede almacenarse a 4 °C durante 1-2 semanas o al menos 12 semanas a -20 °C.
Tubos de concentración (100.000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	El MWCO del tubo no es necesariamente de "talla única", siempre y cuando el MWCO sea menor que el peso molecular total de la proteína que se está purificando. El M5a se concentró con un tubo de 30.000 MWCO.
Tinte Coomassie Azul Brillante R-250	ThermoFisher Scientific	Año 20278
Estante de cubreobjetos	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Cubreobjetos: Ensayo de motilidad invertida	Azer Científico	ES0107052
Tubo de diálisis (3500 Dalton MCWO)	Fischer Científico	08-670-5A	El diámetro del tubo de diálisis puede variar, pero el MWCO debe ser el mismo. Los tubos se pueden almacenar en una solución de alcohol al 20% a 4 °C.
DL-Ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Cinta adhesiva de doble cara	Depósito de oficinas	909955
Péptido DYKDDDDK	GenScript	RP10586	Esto se puede disolver en un tampón que contiene 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 3 mM de NaN3 y 10 mM de MOPS (pH 7,2) hasta una concentración final de 50 mg/mL. Se puede almacenar a -20 °C como alícuotas de 300 μL.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Columna de elución	Bio-Rad	761-1550	Estos se pueden reutilizar. Para limpiar, enjuague la columna con 2-3 volúmenes de columna de PBS y agua destilada. Enfríe la columna a 4° C antes de usarla.
etanol	Fischer Científico	A4094
glucosa	Millipore Sigma	G8270
Glucosa oxidasa	Millipore Sigma	G2133
Solución tampón de glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L	Biotecnología de Santa Cruz	SC-295018
Hcl	Millipore Sigma	320331
Kcl	Fischer Científico	P217-500
Puntas de pipeta de orificio grande	Fischer Científico	02-707-134
Inhibidor de la leupeptina proteasa	ThermoFisher Scientific	78435
Escalera estándar Mark12 sin manchar	ThermoFisher Scientific	LC5677
metanol	Millipore Sigma	MX0482
Portaobjetos de microscopio	Fischer Científico	Teléfono 12-553-10
Mops	Fischer Científico	BP308-100
mPEG-silano	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris Mini Gel de Proteína, 15 pocillos	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
Búfer de muestras NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	El PMSF puede elaborarse como una solución madre de 0,1 M en isopropanol y almacenarse a 4 °C. La adición de isopropanol da lugar a la precipitación de cristales, que pueden disolverse agitando a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de su uso, PMSF se puede añadir gota a gota a una solución de agitación rápida hasta una concentración final de 0,1 mM.
Afeitar	Depósito de oficinas	397492
Rodamina-Faloidina	ThermoFisher Scientific	R415	El caldo se puede diluir en metanol al 100% hasta una concentración final de 200 μM.
Medios de comunicación SF9	ThermoFisher Scientific	12658-027	Esto debe almacenarse a 4° C. Su vida útil es de 18 meses a partir de la fecha de fabricación.
Placa de cultivo de tejidos - Ensayo invertido	Corning	353003	Cada placa de cultivo de tejidos puede contener aproximadamente cuatro cubreobjetos.
Puntas de pipeta de 200 μL de lados lisos	Thomas Científico	1158U38
equipo
centrífuga	ThermoFisher Scientific	75006590
microscopio	Nikon	Modelo: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con objetivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
Cámara microscópica	Andor	Modelo: cámara iXon DU888 EMCCD (formato de sensor de 1024 x 1024)
Caja de control ambiental para microscopio	Tokai HIT	Thermobox personalizado
Unidad láser de microscopio	Nikon	Unidad de cuatro láseres LU-n4 con láseres de estado sólido para 405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm
Centrífuga de banco medio	ThermoFisher Scientific	Modelo: CR3i
Sonicador Misonix	Misonix	XL2020
Ultracentrífuga de sobremesa Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315
Limpiador de plasma	Diener electronic GmbH + Co. KG	Tipo de sistema: Zepto
Sonda sonicadora (3,2 mm)	Qsonica	4418
Incubadora estándar	carpeta	Modelo: 56
Mezclador de tubo Waverly	Waverly	TR6E