Ensayo de motilidad invertida: una técnica in vitro para visualizar el movimiento de la miosina en filamentos de actina inmovilizados

Resumen

Fuente: Tripathi, A., et al. Adaptaciones específicas de miosina de los ensayos de motilidad basados en microscopía de fluorescencia in vitro. J. Vis. Exp. (2021).

En este video, realizamos un ensayo de motilidad in vitro para analizar las interacciones actina-miosina. El movimiento de deslizamiento de los filamentos de actina sobre las moléculas de miosina inmovilizadas se visualiza mediante microscopía de fluorescencia.

Protocolo

1. Purificación de proteínas

1. Lisis celular y extracción de proteínas
   1. Prepare un búfer de extracción de 1,5x basado en la Tabla 1. Filtrar y almacenar a 4 °C.
   2. Comience a descongelar los gránulos de células en hielo. Mientras se descongelan los gránulos, complemente 100 mL de tampón de extracción con 1,2 mM de ditiotreitol (DTT), 5 μg/mL de leupeptina, 0,5 μM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) y dos comprimidos de inhibidores de la proteasa. Mantener en hielo.
   3. Una vez que el pellet se haya descongelado, agregue 1 mL del tampón de extracción suplementado por cada 10 mL de cultivo celul....

Resultados

Figura 1: Preparación de cámaras de celda de flujo funcionalizadas.(A) Comience con un portaobjetos de microscopio limpio, dos pedazos de cinta adhesiva de doble cara cortados a aproximadamente 2 cm y un cubreobjetos funcionalizado. (B) Agregue la cinta al centro del portaobjetos del microscopio. (C) Fije el cubreobjetos a la cinta con el recubrimien.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución de 2 M de MgCl2	VWR	10128-298
Solución de NaCl de 5 M	KD Medicina	RGE-3270
ácido acético	ThermoFisher Scientific	984303
Gel de afinidad Anti-FLAG M2	Millipore Sigma	A2220	https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATP	Millipore Sigma	A7699
G-actina biotinilada	Citoesqueleto, Inc.	AB07
Albúmina sérica bovina	Millipore Sigma	5470
bPEG-silano	Laysan Bio, Inc	Biotina-PEG-SIL-3400-1g
Concentrado de reactivo Bradford	Bio-Rad	5000006
calmodulina		PMID: 2985564
catalasa	Millipore Sigma	C40
Línea celular (SF9) en SF-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	11496015	http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
Papel de filtro circular - Ensayo invertido	Millipore Sigma	WHA1001090
Comprimidos completos de inhibidores de la proteasa sin EDTA	Millipore Sigma	5056489001	Debe almacenarse a 4 °C. Los comprimidos se pueden utilizar directamente o se pueden reconstituir como una solución madre 25x disolviendo 1 comprimido en 2 mL de agua destilada. La solución resultante puede almacenarse a 4 °C durante 1-2 semanas o al menos 12 semanas a -20 °C.
Tubos de concentración (100.000 MWCO)	EMD Millipore Corporation	UFC910024	El MWCO del tubo no es necesariamente de "talla única", siempre y cuando el MWCO sea menor que el peso molecular total de la proteína que se está purificando. El M5a se concentró con un tubo de 30.000 MWCO.
Tinte Coomassie Azul Brillante R-250	ThermoFisher Scientific	Año 20278
Estante de cubreobjetos	Millipore Sigma	Z688568-1EA
Cubreobjetos: Ensayo de motilidad invertida	Azer Científico	ES0107052
Tubo de diálisis (3500 Dalton MCWO)	Fischer Científico	08-670-5A	El diámetro del tubo de diálisis puede variar, pero el MWCO debe ser el mismo. Los tubos se pueden almacenar en una solución de alcohol al 20% a 4 °C.
DL-Ditiotreitol	Millipore Sigma	D0632
Cinta adhesiva de doble cara	Depósito de oficinas	909955
Péptido DYKDDDDK	GenScript	RP10586	Esto se puede disolver en un tampón que contiene 0,1 M de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 3 mM de NaN3 y 10 mM de MOPS (pH 7,2) hasta una concentración final de 50 mg/mL. Se puede almacenar a -20 °C como alícuotas de 300 μL.
EGTA	Millipore Sigma	E4378
Columna de elución	Bio-Rad	761-1550	Estos se pueden reutilizar. Para limpiar, enjuague la columna con 2-3 volúmenes de columna de PBS y agua destilada. Enfríe la columna a 4° C antes de usarla.
etanol	Fischer Científico	A4094
glucosa	Millipore Sigma	G8270
Glucosa oxidasa	Millipore Sigma	G2133
Solución tampón de glicina, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L	Biotecnología de Santa Cruz	SC-295018
Hcl	Millipore Sigma	320331
Kcl	Fischer Científico	P217-500
Puntas de pipeta de orificio grande	Fischer Científico	02-707-134
Inhibidor de la leupeptina proteasa	ThermoFisher Scientific	78435
Escalera estándar Mark12 sin manchar	ThermoFisher Scientific	LC5677
metanol	Millipore Sigma	MX0482
Portaobjetos de microscopio	Fischer Científico	Teléfono 12-553-10
Mops	Fischer Científico	BP308-100
mPEG-silano	Laysan Bio, Inc	MPEG-SIL-2000-1g
NaN3	Millipore Sigma	S8032
NeutrAvidin	ThermoFisher Scientific	31050
NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris Mini Gel de Proteína, 15 pocillos	ThermoFisher Scientific	NP0323PK2
Búfer de muestras NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007
solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4	ThermoFisher Scientific	10010023
PMSF	Millipore Sigma	78830	El PMSF puede elaborarse como una solución madre de 0,1 M en isopropanol y almacenarse a 4 °C. La adición de isopropanol da lugar a la precipitación de cristales, que pueden disolverse agitando a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de su uso, PMSF se puede añadir gota a gota a una solución de agitación rápida hasta una concentración final de 0,1 mM.
Afeitar	Depósito de oficinas	397492
Rodamina-Faloidina	ThermoFisher Scientific	R415	El caldo se puede diluir en metanol al 100% hasta una concentración final de 200 μM.
Medios de comunicación SF9	ThermoFisher Scientific	12658-027	Esto debe almacenarse a 4° C. Su vida útil es de 18 meses a partir de la fecha de fabricación.
Placa de cultivo de tejidos - Ensayo invertido	Corning	353003	Cada placa de cultivo de tejidos puede contener aproximadamente cuatro cubreobjetos.
Puntas de pipeta de 200 μL de lados lisos	Thomas Científico	1158U38
equipo
centrífuga	ThermoFisher Scientific	75006590
microscopio	Nikon	Modelo: Eclipse Ti con sistema H-TIRF con objetivo TIRF 100x (N.A. 1.49)
Cámara microscópica	Andor	Modelo: cámara iXon DU888 EMCCD (formato de sensor de 1024 x 1024)
Caja de control ambiental para microscopio	Tokai HIT	Thermobox personalizado
Unidad láser de microscopio	Nikon	Unidad de cuatro láseres LU-n4 con láseres de estado sólido para 405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm
Centrífuga de banco medio	ThermoFisher Scientific	Modelo: CR3i
Sonicador Misonix	Misonix	XL2020
Ultracentrífuga de sobremesa Optima Max-XP	Beckman Coulter	393315
Limpiador de plasma	Diener electronic GmbH + Co. KG	Tipo de sistema: Zepto
Sonda sonicadora (3,2 mm)	Qsonica	4418
Incubadora estándar	carpeta	Modelo: 56
Mezclador de tubo Waverly	Waverly	TR6E