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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las pautas institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local
1. Sensibilización pasiva de células huRBL
- Centrifugar la suspensión de Ag8/suero preincubada durante 5 min a 250 x g.
- Transfiera 50 μL de la suspensión de Ag8/suero centrifugada a cada pocillo que contenga células de huRBL sin alterar el pellet de células de Ag8.
- Incluyen el control sin antígenos, que son células sensibilizadas, pero no estimuladas (no se añade antígeno), que sirven como indicación de la meseta/fondo de la señal inferior. Los pozos de control de fondo y de máxima lisis no necesitan ser sensibilizados con suero. En su lugar, agregue 50 μL de medio huRBL para controlar los pocillos.
- Cubra la placa con la tapa e incube durante la noche a 37 °C y 5%-7% de CO2.
2. Degranulación estimulada por antígenos y liberación de mediadores
- Prepare la dilución del antígeno en 1x tampón Tyrode (9,5 g/L de sales de Tyrode, 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,5 g/L de hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3) en dH2O) con antelación. Se necesita una cantidad final de 100 μL por pocillo.
nota: No todos los alérgenos, ya sea purificados a partir de fuentes naturales o producidos de forma recombinante, podrían ser estables en el tampón de Tyrode 1x. Por lo tanto, realice pruebas de estabilidad en el tampón Tyrode 1x antes del procedimiento de ensayo. Alternativamente, diluya 1x el tampón Tyrode en óxido de deuterio (D2O) para aumentar la relación señal-ruido del ensayo.
- Realice 8 diluciones del antígeno de interés de una serie de diluciones 1:10 en tubos de reacción comenzando con 10 o 1 μg/mL de proteína.
NOTA: Pruebe siempre la serie de diluciones de antemano. Alternativamente, adapte la serie de dilución 1:10 (por ejemplo, 1:5, 1:20 o 1:30) para cubrir toda la curva de liberación. Además, la concentración inicial puede variar en función de la configuración experimental.
- Para lavar las células huRBL plateadas en la placa de 96 pocillos, retire primero el medio celular que contiene sueros aspirando, invirtiendo y golpeando cuidadosamente la placa sobre papel absorbente.
- Lavar las celdas con 200 μL de tampón Tyrodes 1x por pocillo. Trate todos los pozos de manera similar.
nota: Agregue la solución de lavado lentamente a las celdas para no molestarlas.
- Déjalo actuar durante aproximadamente 30 s y repite el paso de lavado tres veces en total.
- Después de agregar la solución de lavado por última vez, deje la solución en los pocillos hasta que esté lista para continuar con la dilución del antígeno.
nota: Evite exponer las células al aire durante demasiado tiempo.
- Transfiera 100 μL de solución de antígeno a cada pocillo que contenga las células huRBL presensibilizadas.
NOTA: Si se analizan varios parámetros diferentes, transfiera las muestras individuales de la serie de dilución a una placa adicional de 96 pocillos no vinculante (utilice el mismo diseño que en la placa huRBL) y transfiéralas posteriormente con una pipeta multicanal directamente a la placa de células huRBL. De este modo, se puede evitar la exposición de las células al aire durante demasiado tiempo, lo que podría dar lugar a un rendimiento deficiente del ensayo (señal más baja/nula).
- Cubra los pozos de control (lisis máxima y células de fondo no sensibilizadas) con 100 μL de tampón Tyrode 1x. No estimule estos pozos de control con el antígeno.
- Además, agregue 100 μL de tampón Tyrode 1x a los pocillos sensibilizados sin antígeno de la serie de dilución, lo cual es necesario para tener en cuenta la liberación espontánea independiente del antígeno de las células sensibilizadas durante el análisis de datos.
- Incubar células huRBL durante 1 h a 37 °C y 5%-7% de CO2.
3. Medición de fluorescencia de la actividad de la β-hexosaminidasa
- Tratar los pocillos del control de máxima lisis con 10 μL de Triton X-100 al 10% por pocillo y mezclar adecuadamente para lisar completamente las células y obtener la liberación del 100% de β-hexosaminidasa.
- Añada 50 μL de solución de sustrato en una nueva placa de 96 pocillos no vinculante. Solución de sustrato para una placa de 96 pocillos: 5 mL de tampón de ensayo cítrico 0,1 M, pH 4,5; y 80 μL de 4-metilumbeliferol N-acetil-β-D-glucosaminida de 10 mM.
- Transfiera 50 μL de sobrenadante celular de todos los pocillos a la nueva placa que contiene la solución de sustrato.
NOTA: Pipetear cuidadosamente el sobrenadante de la placa de huRBL para no alterar las células de huRBL.
- Incubar la placa con solución de sustrato y sobrenadante celular durante 1 h a 37 °C para permitir la conversión del sustrato fluorogénico.
nota: Conserve la placa huRBL para el ensayo de viabilidad celular.
- Añadir 100 μL de solución de parada (15 g/L de glicina, 11,7 g/L de NaCl disuelto en dH2O, pH 10,7) por pocillo.
- Mida la fluorescencia a 360 nm de excitación y 465 nm de emisión utilizando un lector de placas.