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1. Cribado de alto rendimiento (HTS) de inhibición del crecimiento
NOTA: La actividad inhibidora del crecimiento de los agentes anticancerígenos contra organoides tumorales (PDOs) derivados del paciente se evalúa midiendo el contenido de ATP intracelular, como se muestra en la Figura 1. Este paso se realiza utilizando un kit de ensayo de viabilidad celular disponible en el mercado (ver Tabla de Materiales).
- En el día 0, cultive las PDOs (p. ej., RLUN007) en matraces hasta que se disponga de un número adecuado de grupos de células para el ensayo. Un día antes de la siembra, transfiera la suspensión de PDO de un matraz de 75cm2 a un tubo de 15 mL y centrifugue a 200 x g durante 2 min para medir el volumen de pellets de PDO. A continuación, vuelva a suspender el pellet de PDO en 15 mL de medio fresco y transfiéralo de nuevo a un matraz de 75cm2. Cultive las células a 37 °C en 5% CO2.
nota: El volumen de pellets de PDO requerido depende de la tasa de dilución de cada PDO y del número de placas de 384 pocillos utilizadas para el ensayo. Para RLUN007, se necesita un volumen de pellets de celda de 200 μL para sembrar en diez placas de 384 pocillos.
- El día 1 (24 h después de cambiar el medio), picar las PDOs utilizando equipos de fragmentación y dispersión celular (ver Tabla de Materiales) con un portafiltros que contenga un filtro de malla de 70 μm. A continuación, diluya 15 mL de la suspensión de PDO 10 veces. Siembre 40 μL de la suspensión de PDO en microplacas esferoides de fijación ultra baja (fondo redondo) de 384 pocillos (ver Tabla de Materiales) utilizando un dispensador de suspensión de celdas (ver Tabla de Materiales).
nota: Para picar grupos de células, se recomienda utilizar el equipo de fragmentación y dispersión de células disponible en el mercado (véase la Tabla de Materiales).
- A las 24 h después de la siembra (día 2), tratar las DOP con 0,04 μL de soluciones de agente de prueba en rangos de concentración final de 20 μM a 1,0 nM (10 diluciones en serie) utilizando un manipulador de líquidos (ver Tabla de Materiales).
- El día 8 (144 h después del tratamiento con la sustancia problema), agregue el reactivo de medición de ATP intracelular a los pocillos de prueba. Mezclar las placas con un mezclador e incubar durante 10 min a 25 °C. Mida el contenido de ATP intracelular como luminiscencia utilizando un lector de placas (ver Tabla de Materiales).
- Para calcular la viabilidad de la celda, divida la cantidad de ATP en los pozos de prueba por la de los pozos de control que contienen el vehículo, restando el fondo. Para calcular la tasa de crecimiento durante 6 días, divida la cantidad de ATP en los pozos de control del vehículo por la que hay en los pozos de control del vehículo 24 h después de la siembra.
- Calcule los valores de concentración inhibitoria del 50% (IC50) y área bajo la curva (AUC) a partir de las curvas dosis-respuesta utilizando un software de análisis de datos biológicos (ver Tabla de Materiales). El factor Z es un parámetro adimensional que oscila entre 1 (separación infinita) y <0, definido como Z = 1 - (3σc+ + 3σc-) / |μc+ - μc-|, donde σc+, σc-, μc+ y μc- son las desviaciones estándar (σ) y promedios (μ) de los controles alto (c+) y bajo (c-), respectivamente.
