Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando: una técnica de alto rendimiento para identificar proteínas intracelulares de unión a segundo mensajero de nucleótidos bacterianos

1. Preparación de lisados de células enteras

1. Inocular las cepas de la colección de E. coli K-12 ASKA ORFeome en 1,5 mL de caldo de lisogénia (LB) que contiene 25 μg/mL de cloranfenicol en placas de 96 pocillos profundos. Cultivar durante la noche (O/N) durante 18 h a 30 °C con agitación a 160 rpm. Al día siguiente, añadir isopropil β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (0,5 mM finales) a los cultivos O/N para inducir la expresión de proteínas a 30 °C durante 6 h.
2. Celdas de pellets a 500 x g durante 10 min. Congele los pellets a -80 °C hasta su uso. Para lisar las células, añadir 150 μL de tampón de lisis L1 (40 mM de Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl₂, suplementado con 2 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 40 μg/mL de DNasa 1 y 0,5 mg/mL de lisozima) para resuspender el pellet.
3. Congele las células a -80 °C durante 30 minutos y luego descongele a 37 °C durante 20 minutos. Repita este ciclo tres veces para lisar las células. Almacene los lisados a -80 °C antes de su uso.

2. Purificación de Rel_seq y GppA

NOTA: Las proteínas recombinantes Rel_seq de Streptococcus equisimilis y GppA de E. coli K-12 se utilizan para sintetizar las pppGpp y ppGpp radiomarcadas, respectivamente.

1. Crecen y recolectan células que sobreexpresan cada proteína.
   1. Cultive la cepa de E. coli BL21 DE3 hasta la fase exponencial (densidad óptica [DO] ~ 0.3-0.4) en caldo LB, y centrifugar 1 mL de cultivo a 6000 x g durante 5 min. Decantar el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de caldo TSB helado (caldo LB suplementado con 0,1 g/mL PEG3350, 0,05 mL/mL de dimetilsulfóxido, 20 mM MgCl₂).
   2. Mezclar los plásmidos que llevan relseq y gppA marcados con histidina, cada uno de 100 ng, con las suspensiones celulares anteriores en TSB, e incubar en hielo durante 30 min. Calentar las células a 42 °C durante 40 s. Colocar la mezcla en hielo durante 2 min, y añadir 1 mL de caldo LB a temperatura ambiente para permitir que las células se recuperen durante 1 h a 37 °C con agitación a 160 rpm.
   3. Colocar las células recuperadas en placas de agar LB suplementadas con los antibióticos correspondientes (Rel_seq:100 μg/mL de ampicilina; GppA: 30 μg/mL de kanamicina). Al día siguiente, inocular las colonias en caldo LB para iniciar los precultivos O/N de ambas cepas a 37 °C.
   4. A las 18 h, inocular 500 mL de medio LB con 10 mL de los cultivos O/N y los antibióticos correspondientes. Cultive los cultivos agitándolos a 160 rpm a 37 °C. Cuando el diámetro exterior de_{600 nm} alcance 0,5-0,7, induzca la expresión de proteínas agregando 0,5 mM de IPTG y crezca durante 3 h a 30 °C con agitación a 160 rpm.
   5. Recoja las células girando a 6084 x g durante 10 min a 4 °C. Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada y vuelva a centrifugar a 1912 x g durante 20 min a 4 °C. Decantar el sobrenadante y congelar los pellets a -20 °C antes de usar.
2. Purificación por afinidad del ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA)
   nota: A partir de este punto, asegúrese de que las muestras estén frías.
   1. Añadir 40 mL de tampón de lisis frío L2 (50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 5% de glicerol, 10 mM de imidazol, 10 mM de β-mercaptoetanol suplementado con inhibidores de la proteasa (comprimido sin EDTA; ver la Tabla de Materiales) para resuspender el pellet. Lisar las células mediante sonicación (60% de amplitud, 2 s ON/4 s OFF durante 8 min ON). Aclarar el lisado girando a 23.426 x g durante 40 min a 4 °C, y continuar con el sobrenadante para la purificación.
   2. Durante la centrifugación anterior, prepare la resina Ni-NTA.
      1. Transfiera 500 μL de resina Ni-NTA homogeneizada a una columna de cromatografía de polipropileno permanente, y déjela reposar durante 15 minutos y drene la solución de almacenamiento. Lave la resina con 15 mL de agua ultrapura dos veces y luego lave la columna con 15 mL del tampón de lisis L2.
   3. Cargue el sobrenadante aclarado del lisado celular del paso 1 en la columna y deje que fluya a través de él. Lavar la columna con 30 mL de tampón de lavado (50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 5% de glicerol, 20 mM de imidazol).
   4. Eluir las proteínas con 400 μL del tampón de elución (50 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl, 5% de glicerol, 500 mM de imidazol) tres veces. A continuación, repita la elución con otros 300 μL del tampón de elución. Combine las proteínas eluidas hasta obtener un volumen final de 700 μL.
3. Filtración de gel
   1. Prepare el tampón de filtración de gel (50 mM de Tris, pH 7,5; 200 mM de NaCl; 5% de glicerol). Lave la columna de exclusión de tamaño con un volumen de columna (25 ml) del tampón de filtración de gel.
   2. Cargue la muestra anterior de 700 μL utilizando un bucle de 500 μL, ejecute a 0,5 mL/min y recoja 2-3 fracciones, cada una de 0,5 mL de volumen, que contengan las proteínas respectivas.
   3. Combine y concentre las fracciones que contienen cada una de las proteínas utilizando una columna de centrifugación, y mida la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.

3. Síntesis de ³²pppGpp y ppGpp marcados con P

1. Ensamble una reacción Rel_seq a pequeña escala en un tubo con tapón de rosca (consulte la Tabla 1).
   nota: Trabaje con reactivos radiactivos solo en un lugar autorizado y con equipo de protección personal.
2. Incubar el tubo a 37 °C en una termobatidora durante 1 h, luego a 95 °C durante 5 min, y colocar en hielo durante 5 min. Girar la proteína precipitada a 15.700 x g durante 5 min, y transferir el sobrenadante (sintetizado ³²P-pppGpp) a un nuevo tubo con tapón de rosca.
3. Para sintetizar ³²P-ppGpp a partir de ³²P-pppGpp, transfiera la mitad del producto ³²P-pppGpp a un nuevo tubo de tapón de rosca y agregue 1 μM GppA. Incubar el tubo a 37 °C durante 10 min, a 95 °C durante 5 min, y luego colocar en hielo durante 5 min.
4. Centrifugar la proteína precipitada a 15.700 x g durante 5 min, y transferir el sobrenadante (³²P-ppGpp sintetizado) a un nuevo tubo con tapón de rosca.
5. Analice los ³²P-pppGpp y ³²P-ppGpp ejecutando 1 μL de las muestras en una placa de cromatografía en capa fina (TLC) (placas TLC de celulosa modificada con polietileneimina) utilizando el 1,5 M KH₂PO₄, pH 3,4, como fase móvil.
   nota: Utilice la guanosina 5'-trifosfato marcada con ^α-32P (³²P-α-GTP) como control.
6. Seque completamente la placa TLC, colóquela entre una carpeta de plástico transparente y expóngala a una pantalla de fósforo de almacenamiento durante 5 min. Visualice y cuantifique las señales mediante el uso de un phosphorimager.
   nota: Cuando las proporciones de ³²P-pppGpp y ³²P-ppGpp son superiores al 85%, se puede ensamblar y sintetizar una reacción a gran escala (500 μL, suficiente para el cribado de 20 placas de 96 pocillos) utilizando la Tabla 1.

4. Cribado de DRaCALA de las proteínas diana de (p)ppGpp

1. Descongele y transfiera 20 μL de lisados de células enteras a una placa de microtitulación de fondo en V de 96 pocillos. Añadir 2,5 U/pocillo de la endonucleasa de Serratia marcescens e incubar a 37 °C durante 15 min para reducir la viscosidad del lisado. Coloque los lisados en hielo durante 20 min.
2. Mezcle los ³²P-pppGpp y ³²P-ppGpp en una proporción de 1:1 y agregue 1x tampón de lisis L1 para que la concentración final de (p)ppGpp sea igual a 4 nM.
   nota: Dada la similitud química entre pppGpp y ppGpp, una mezcla de ambos productos químicos simplificará el proceso de cribado.
3. Utilice una pipeta multicanal y puntas de pipeta filtradas para añadir y mezclar 10 μL de la mezcla de (p)ppGpp con el lisado celular. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
4. Lave la herramienta de alfiler 96 x colocándola en una solución de detergente no iónico al 0,01 % durante 30 s y séquela en papel de seda durante 30 s. Repita el lavado de la herramienta de alfiler 3 veces.
5. Coloque la herramienta de alfiler en las placas de muestra de 96 pocillos anteriores y espere 30 s. Levante la herramienta de alfiler hacia arriba y colóquela hacia abajo sobre una membrana de nitrocelulosa durante 30 s.
   nota: Si falta una mancha, localice 2 μL de las muestras correspondientes con una pipeta y puntas filtradas. Es aconsejable hacer un duplicado de la misma muestra como se indica a continuación.
6. Seque la membrana durante 5 min en RT. Coloque la membrana entre una carpeta de plástico transparente y expóngala a una pantalla de fósforo de almacenamiento durante 5 min. Visualice utilizando un generador de imágenes de fósforo.

5. Cuantificación e identificación de posibles proteínas diana

1. Utilice el software de análisis asociado con el phosphorimager para abrir el archivo .gel de las placas visualizadas. Utilice la función de análisis de matriz para definir los 96 puntos configurando una cuadrícula de 12 columnas x 8 filas.
2. Defina círculos grandes para circunscribir el borde exterior de todas las manchas (consulte la Figura 1). Exporte el Volumn+Fondo y el Área de los círculos grandes definidos, y guárdelos en una hoja de cálculo.
   nota: Si es necesario, vuelva a colocar cada círculo individual para que se superponga perfectamente con los puntos y cambie el tamaño de cada círculo individual para que sea un poco más grande que el punto real.
3. Reduzca el tamaño de los círculos definidos para circunscribir los pequeños puntos interiores. Exporte el volumen + fondo y el área de los círculos pequeños definidos y guárdelos en una hoja de cálculo.
4. Calcule las fracciones de enlace en la hoja de cálculo utilizando la ecuación de la Figura 1 y represente los datos. Identificar las proteínas de unión potenciales en los pozos que muestran fracciones de unión altas en comparación con la mayoría de los otros pocillos.

Tabla 1: Recopilación de información para las reacciones de síntesis a pequeña y gran escala de ³²pppGpp. *El tampón Relseq 10x contiene 250 mM de Tris-HCl, pH 8,6; 1M NaCl; 80 mM MgCl₂. Abreviatura: pppGpp = pentafosfato de guanosina.

Figura 1: Cuantificación y cálculo de la fracción vinculante. Consulte el texto para obtener más detalles. Brevemente, las manchas de DRaCALA se analizarán dibujando dos círculos que circunscriban toda la mancha y el punto oscuro interior (es decir, el (p)ppGpp retenido debido a la unión de la proteína probada). La señal de enlace específica es la señal radiactiva del círculo interior (S1) después de restar la señal de fondo inespecífica (calculada por A1 × ((S2-S 1)/(A2-A 1))). La fracción de enlace es la señal de enlace específica dividida por la señal radiactiva total (S2). Abreviaturas: DRaCALA = Acción capilar radial diferencial del ensayo de ligando; (p)ppGpp = pentafosfatos y tetrafosfatos de guanosina; RT = temperatura ambiente.