Ensayo de imágenes con sonda fluorescente: una técnica para visualizar el estrés oxidativo en las células organoides intestinales cultivadas tratadas con inductor de especies reactivas de oxígeno

Resumen

Fuente: Stedman, A. et al., Análisis del estrés oxidativo en organoides intestinales murinos utilizando una sonda fluorogénica sensible a las especies de oxígeno reactivo. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe la técnica de visualización del estrés oxidativo en organoides cultivados. Este trabajo ayuda a comprender el nivel de estrés oxidativo debido a la acumulación de ROS en los distintos tipos celulares presentes en un organoide después del tratamiento con diferentes moduladores de ROS.

Protocolo

1. Visualización del estrés oxidativo en organoides 3D mediante microscopía confocal

1. Tome los organoides sembrados en las cámaras de 8 pocillos μ-Slide y agregue 1 μL de N-acetilcisteína o solución madre de NAC en los pocillos correspondientes para obtener una concentración final de 1 mM.
2. Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO₂.
3. Añadir 1 μL de solución madre de tBHP en los pocillos correspondientes para obtener una concentración final de 200 μM.
4. Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de_CO2.
5. Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 1,25 mM de la sonda fluorogénica para obtener una concentración final de 5 μM.
6. Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 1,25 mg/mL de Hoechst para obtener una concentración final de 5 μg/mL.
7. Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de_CO2.
8. Retire el medio sin alterar el BMM. Suavemente, agregue 250 μL de DMEM tibio sin rojo fenol.
   nota: Si se planea una adquisición a largo plazo, agregue compuestos de factores de crecimiento al DMEM sin rojo fenol.
9. Obtener imágenes de los organoides utilizando un microscopio confocal equipado con una cámara térmica y un suministro de gas que detecta la sonda fluorogénica (ROS).
   nota: La excitación/emisión (ex/em) de la sonda fluorogénica es de 644/665, ex/em para Hoechst (núcleos) es de 361/486 y ex/em para GFP (células madre intestinales de los ratones Lgr5-GFP) es de 488/510. Se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 63x para detectar señales en las células madre. No cambie la configuración del láser entre muestras. Se puede utilizar un objetivo de 20x para permitir una visión general de la producción de ROS.
10. Utilice el control positivo para configurar la intensidad del láser y el tiempo de exposición para la señal ROS y verifique que esta señal sea más baja en el control negativo.
11. Con el ocular, examine el portaobjetos para identificar los organoides GFP que se expresan y ajustar la intensidad del láser.
    nota: Este paso se realiza manualmente.
12. Defina las posiciones para obtener una imagen cosida de todo el organoide. Configure una pila z de 25 μm (tamaño de paso de 5 μm) para obtener una sección de los organoides que muestre una capa de células.
    nota: Consulte el manual del usuario del microscopio para optimizar la configuración. Con células vivas, la adquisición debe realizarse dentro de 1 h después del final de la incubación.
13. Abra las imágenes en un software de procesamiento de imágenes de código abierto (consulte Tabla de materiales).
14. Revisa la pila z y elige la sección en la que el centro de los organoides esté bien representado y crea una nueva imagen con el área seleccionada.
15. Cuantifique las imágenes según los siguientes pasos.
    1. Seleccione la herramienta de línea a mano alzada.
    2. Dibuja una línea siguiendo los núcleos.
       nota: Seleccione solo las regiones que presentan células GFP positivas si solo se analizan las células madre.
    3. Aumente el ancho de la línea para cubrir la capa de celda con la línea sin incluir los residuos luminales.
    4. Seleccione el canal para la señal ROS y mida la intensidad de fluorescencia en la región seleccionada y anote los valores.
    5. Dibuja una línea donde no haya señal y mide la intensidad fluorescente del fondo que se restará del valor anterior para obtener la intensidad final.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ratón
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5- GFP)	El Laboratorio Jackson
Medio de cultivo de crecimiento
DMEM F12 avanzado (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
Penicilina-estreptomicina (P/S)	ThermoFisher	15140122	Concentración de stock: 100x (10.000 unidades/mL de penicilina y 10.000 μg/mL de estreptomicina)
FLuoroBrite DMEM (DMEM sin rojo fenol)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock a 10 mg/mL
Factor de crecimiento Matrigel reducido, libre de rojo fenol (matriz de membrana basal)	Corning	356231	una vez recibido, descongelar O/N en la nevera, conservar durante 1h en hielo y, hacer 500 mL de alícuotas y almacenar a -20 °C
μ-Slide 8 Cámaras de pozos	Ibidi	80826
N-acetilcisteína (NAC)	sigma	A9165
solución de hidroperóxido de terc-butilo (tBCHP) (70% en peso. En H2O2)	sigma	458139
Programas y Equipos
Fiyi/ImageJ			https://imagej.net/software/fiji/ Generación de imágenes de descargas
Observador.Z1	Zeiss		Sistema confocal
Opterra (confocal de campo barrido)	Bruker		Sistema confocal
Cámara EMCCD de alta velocidad Evolve Delta 512	Fotometría		Sistema confocal
prisma	Software GraphPad		análisis estadístico