Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de reactivos y materiales para el cultivo de organoides intestinales
- Para preparar el medio de cultivo de crecimiento, mezcle DMEM/F-12 avanzado suplementado con 1x glutamina, 1x solución de penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL de EGF murino, 20 μg/mL de Noggin murino, 500 ng/mL de R-Spondin1 de ratón (ver Tabla de Materiales). Deje el medio a temperatura ambiente (RT) durante la extracción de la cripta.
nota: Congele el medio no utilizado en alícuotas a -20 °C. Evite congelar y descongelar.
- Llene un tubo de 50 mL con 40 mL de DMEM/F-12 Avanzado y manténgalo en hielo.
nota: Mantenga el medio no utilizado a 4 °C. Se utilizará para el paso de organoides.
- Precalentar las placas de cultivo celular (fondo redondo de 96 pocillos) en la incubadora a 37 °C.
- Descongele la matriz de membrana basal (BMM) (ver Tabla de Materiales) alícuotas en hielo (antes de iniciar el protocolo o al menos 1 h antes de enchapar las criptas).
nota: El BMM se solidificará rápidamente si no se mantiene frío.
- Prepare la solución de lavado/lavado agregando una solución de penicilina-estreptomicina al 1% a DPBS (DPBS-P/S).
- Llene una placa de Petri de 100 mm con 10 mL de DPBS-P/S frío. Llene seis tubos de 15 mL con 10 mL de DPBS y etiquételos de F1 a F6.
- Prepare 30 mL de solución de EDTA 10 mM por dilución de EDTA 0,5 M en DPBS. Llene dos tubos de 15 mL con 10 mL de EDTA de 10 mM y etiquételos como E1 y E2.
- Mantenga todas las soluciones preenfriadas a 4 °C y manténgalas en el hielo durante el procedimiento.
2. Cultivo de organoides intestinales
- Sacrifique un ratón Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8 a 10 semanas de edad de acuerdo con las normas y reglamentos nacionales.
- Recoja 5-8 cm del yeyuno que abarca la región entre el duodeno (a 5 cm del estómago) y el íleon (a 10 cm del ciego) y manténgalo en DPBS-P/S frío sobre hielo.
- Limpie el contenido intestinal enjuagando con 5-10 mL de DPBS-P/S.
nota: Las jeringas de lavado caseras se pueden obtener conectando una punta de 200 μL a una boquilla de jeringa de 10 mL.
- Abra el intestino longitudinalmente con unas tijeras de punta esférica (consulte la tabla de materiales) (para evitar dañar el tejido).
- Con pinzas, transfiera el tejido a una placa de Petri que contenga DPBS-P/S frío a temperatura ambiente y agítelo para enjuagar.
- Con una pipeta Pasteur de plástico, agarre el intestino por aspiración y transfiéralo a un tubo de 15 mL etiquetado como E1 que contiene 10 mL de EDTA frío y 10 mM.
- Invierta el tubo 3 veces e incube en hielo durante 10 min.
- Con una pipeta Pasteur de plástico, transfiera el tejido al tubo F1 que contiene 10 mL de DPBS. Vórtice durante 2 min (en vórtice normal, sosteniendo el tubo con la mano y asegurándose de que el intestino se arremoline bien).
- Coloque 10 μL de la fracción en una placa de Petri y evalúe la calidad de la fracción bajo un microscopio.
nota: Todos los pasos del vórtice se realizan a la máxima velocidad, y la calidad de cada fracción debe evaluarse bajo el microscopio (Figura 1).
- Con una pipeta Pasteur de plástico, agarre el intestino por aspiración y transfiéralo en un tubo F2 que contiene 10 mL de DPBS y vórtice durante 2 minutos.
- Repita el paso 2.10, transfiriendo el tejido en el tubo F3 que contiene 10 mL de DPBS y vórtice durante 2 min.
- Repita la incubación de EDTA como en el paso 2.6, transfiriendo el tejido en el tubo E2 que contiene 10 mM de EDTA.
- Invierta el tubo 3 veces e incube en hielo durante 5 minutos.
- Repita el paso 2.10, transfiriendo el tejido en el tubo F4 que contiene 10 mL de DPBS y vórtice durante 3 min.
- Repita el paso 2.14, transfiriendo el tejido en el tubo F5 que contiene 10 mL de DPBS y vórtice durante 3 min.
- Repita el paso 2.15, transfiriendo el tejido en el tubo F6 que contiene 10 mL de DPBS y vórtice durante 3 min.
- Combine las mejores fracciones filtrando por gravedad a través de un filtro de células de 70 μm en un tubo de 50 mL (en hielo) para eliminar las vellosidades y los residuos significativos.
nota: Por lo general, F5 y F6 son las fracciones que contienen numerosas criptas y menos escombros.
- Girar las criptas a 150 x g a 4 °C durante 3 min.
- Vacíe el tubo, rompa el pellet mecánicamente y agregue 5 mL de DMEM/F12 frío.
- Coloque 10 μL de la suspensión en una placa de Petri y cuente manualmente el número de criptas presentes en la alícuota bajo un microscopio><.
nota: No cuente las células individuales o los residuos pequeños.
- Calcule el volumen (V) de suspensión de criptas requerido en μL, considerando que se colocan 300 criptas por pocillo, W es el número de pozos y N es el número de criptas contadas de 10 μL de la suspensión. Transfiera las criptas a un nuevo tubo de 15 mL.
nota: V = 300 x W x 10/N. Si se utiliza un volumen pequeño en el experimento planificado, se puede utilizar un tubo de centrífuga de 1,5 mL.
- Girar las criptas a 200 x g a 4 °C durante 3 min.
- Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.
- Romper mecánicamente el pellet y añadir suavemente el medio de cultivo de crecimiento para obtener una concentración de 90 criptas/μL.
- Añadir 2 volúmenes de BMM sin diluir para obtener una concentración final de 30 criptas/μL. Pipetear cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.
nota: Mantenga siempre el tubo en hielo para evitar la solidificación del BMM.
- Coloque 10 μL de la mezcla crypts/BMM en cada pocillo. Para el análisis de citometría de flujo, utilice placas de 96 pocillos de fondo redondo. Distribuya 10 μL en el centro de cada pocillo como una cúpula.
nota: Coloque los organoides en una capa delgada para el ensayo de imágenes para permitir su obtención de imágenes en profundidad.
- Deje la placa durante 5 minutos en RT para permitir que el BMM se solidifique. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.
- Agregue 250 μL de medio de crecimiento en cada pocillo, teniendo cuidado de no desprender el BMM.
- Coloque las placas en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
- Realizar el análisis de ROS entre los días 4 y 6 de cultivo. De lo contrario, cambie el medio y divida los organoides después de la aparición de varias estructuras en gemación larga y cuando las células muertas se acumulen en los lúmenes de los organoides.
3. Pasaje de organoides
- Comience a pasar los organoides del intestino delgado a partir del6º día de cultivo, cuando se hayan formado estructuras de gemación significativas y los lúmenes de los organoides se hayan oscurecido.
nota: La luz del organoide se oscurece debido a la acumulación de células muertas, desechos y moco. Evite dejar que los organoides crezcan demasiado antes de dividirse. La proporción de división depende del crecimiento de los organoides. Se recomienda pasar los organoides con una proporción de 1:2 en el día 6 y 1:3 en el día 10.
- Llene un tubo de 15 mL con 4 mL de DMEM/F-12 avanzado frío y manténgalo en hielo.
nota: Aquí, se proporcionan volúmenes para una placa de cultivo de 96 pocillos. Si se utiliza un formato diferente, ajuste el volumen en consecuencia.
- Aspire cuidadosamente el medio con una pipeta o una bomba de vacío de los pocillos sin tocar las cúpulas BMM, y deséchelo.
- Añadir 100 μL de DMEM/F-12 avanzado frío por pocillo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para romper el BMM y transferir el contenido del pocillo al tubo de 15 mL.
- Lavar el pocillo con 200 μL de DMEM/F-12 en frío y recogerlo en el mismo tubo.
nota: Si se pasan varios pozos de la misma condición experimental, el contenido de los pozos se puede agrupar en el mismo tubo colector de 15 mL.
- Girar el tubo colector de 15 ml a 100 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM/F-12 avanzado frío al pellet. Con una punta P1000, tome una punta P10 (sin filtro) y pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos 20 veces.
- Agregue 4 mL de Advanced DMEM/F-12 frío al tubo. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4°C.
- Aspire el sobrenadante con una pipeta o una bomba de vacío sin alterar el pellet. Luego, rompa el pellet mecánicamente.
- Añadir BMM diluido en medio de cultivo de crecimiento (proporción 2:1). Pipetear con cuidado hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas de aire en la mezcla.
- Coloque 10 μL de la mezcla crypts/BMM en cada pocillo.
- Mantenga la placa durante 5 minutos en RT para permitir que el BMM se solidifique. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 15 min.
- Agregue 250 μL de medio de crecimiento en cada pocillo.
nota: Tenga cuidado de no separar el BMM.
- Coloque las placas en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2.
4. Preparación de reactivos y materiales para evaluar el estrés oxidativo en organoides intestinales
- Prepare una solución madre de 250 mM de inhibidor N-acetilcisteína (NAC) (ver Tabla de Materiales) y vuelva a suspender 10 mg con 245 μL de DPBS. Utilizar a 1 mM de concentración final.
- Prepare una solución madre de 50 mM de hidroperóxido de terc-butilo inductor (tBHP), al 70% en agua, y diluya 3,22 μL con 496,8 μL de DPBS. Utilizar a una concentración final de 200 μM.
- Para el estudio de citometría de flujo, prepare una solución de trabajo de 250 μM de una sonda fluorogénica (ver Tabla de Materiales) diluyendo la solución madre 1/10 en DMSO. Utilizar a 1 μM de concentración final.
nota: Como se indica en las instrucciones del fabricante, la sonda fluorogénica es sensible a la luz y al oxígeno. Las existencias y las alícuotas no deben abrirse y cerrarse demasiadas veces.
- Preparar una solución final de 0,1 μg/mL DAPI en DPBS, para ser utilizada para la discriminación de células muertas en el ensayo de citometría de flujo.
nota: Estos pasos describen el uso de controles negativos y positivos que deben incluirse en cualquier ensayo, utilizando las condiciones indicadas en la Figura 2A. El ensayo se puede utilizar para analizar compuestos antioxidantes o prooxidantes. Los pasos son los mismos, y la única diferencia es cuando se agregan los compuestos antes de usar el tinte fluorogénico.
5. Cuantificación del estrés oxidativo en los organoides disociados mediante citómetro de flujo
- Agregue 1 μL de solución madre de NAC en los pocillos para controles negativos para obtener una concentración final de 1 mM.
nota: Utilice los organoides recubiertos en las placas de fondo redondo de 96 pocillos.
- Incubar durante 1 h a 37 °C y 5% de CO2.
- Añadir 1 μL de solución madre de tBHP en los pocillos correspondientes para obtener una concentración final de 200 μM.
- Incubar durante 30 min a 37 °C y 5% deCO2.
- Con una pipeta multicanal, retire el medio sin alterar el BMM adjunto y transfiéralo a otra placa inferior redonda de 96 pocillos. Mantenga este plato a un lado.
- Añadir 100 μL de tripsina y, con una pipeta multicanal, pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para destruir el BMM.
- Incubar durante no más de 5 min a 37 °C y 5% deCO2.
- Con una pipeta multicanal, pipetee hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para disociar los organoides.
- Girar a 300 x g durante 5 min a RT.
- Deseche el sobrenadante invirtiendo la placa. Vuelva a añadir el medio recogido en el paso 6.3 a los pocillos correspondientes y vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
- Añadir la sonda fluorogénica a la concentración final de 1 μM. Añadir 1 μL por pocillo de la dilución de 250 μM e incubar durante 30 min a 37 °C y 5% de CO2,
nota: No agregue la sonda fluorogénica a los pocillos necesarios para la configuración del instrumento (Figura 2B).
- Girar a 300 x g durante 5 min a RT.
- Vuelva a suspender las células con 250 μL de solución de DAPI de 0,1 μg/mL. Transfiera las muestras a los tubos de citometría de flujo adecuados, mantenga los tubos en hielo y proceda con el análisis.
nota: Agregue PBS en lugar de DAPI a los pozos necesarios para la configuración del instrumento (Figura 2B).
- Optimice los ajustes de voltaje de dispersión directa y lateral en voltajes de control y láser no teñidos para cada fluoróforo utilizando muestras monoteñidas.
- Utilizando una estrategia de compuerta adecuada (Figura 3A), recopile un mínimo de 20.000 eventos.
NOTA: Se prefieren 50.000 eventos. Los ajustes de adquisición detallados varían según el instrumento utilizado.
