Ensayo de SUMOilación: una técnica in vitro para detectar el estado de SUMOilación de proteínas sustrato mediante inmunotransferencia

Resumen

Fuente: Yang, W. S. et al., Ensayo de SUMOilación in vitro para estudiar la actividad de la ligasa SUMO E3. J. Vis. Exp. (2018)

Este video demuestra el método in vitro para la SUMOilación de proteínas de sustrato utilizando una cascada de enzimas secuencial. Además, el estado SUMOilado de la proteína se identifica mediante la técnica de electroforesis e inmunotransferencia.

Protocolo

1. Preparación de construcciones de expresión de Baculovirus

1. Purifique la ligasa K-bZIP de SUMO E3 clonando el ADNc de K-bZIP en un vector de baculovirus de doble expresión (ver Tabla de Materiales) con una etiqueta de epítopo N-terminal. Hemos tenido éxito utilizando una etiqueta octapeptídica (indicada en todo el protocolo como vector-tag-K-bZIP).
   nota: La plantilla de ADN para la clonación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) K-bZIP es ADNc transcrito inversamente a partir de ARN aislado de células TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 después del tratamiento con doxiciclina.
   1. Transfiera el ADNc K-bZIP de longitud completa al vector de expresión dual con sitios de clonación CpoI. CpoDigiere el producto de PCR y 1 μg del vector de expresión dual a 37 °C durante 3 h.
   2. Separar y extraer el ADN digerido después de la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%. Lije el inserto (K-bZIP) y el vector por ADN ligasa T4 a 16 °C durante 30 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales).
   3. Agregue 5 μL de ADN de ligadura a 50 μL de células competentes de E. coli "A" (ver Tabla de Materiales) en un tubo de 1,5 mL. Poner en hielo durante 30 min. A continuación, incube el tubo de 1,5 ml en un baño de agua a 42 °C durante 45 s e inmediatamente coloque el tubo en hielo durante 3 minutos.
   4. Añadir 600 μL DE MEDIO S.O.C. (0,5% (p/v) de extracto de levadura, 2% (p/v) de triptona, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 20 mM de_MgSO4 y 4% (p/v) de glucosa) en el tubo e incubar a 37 °C durante 1 h. A continuación, centrifugar el tubo a temperatura ambiente durante 3 min a 600 x g.
   5. Retire el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet con 60 μL de medio Luria-Bertani (LB; 1% (p/v) de triptona, 0,5% (p/v) de extracto de levadura y 85 mM de NaCl) y extienda en placas de agar LB que contengan 100 μg/mL de ampicilina. Incubar la placa de agar a 37 °C durante 16 h.
   6. Seleccionar 1 colonia para inocular en medio LB de 5 mL que contenga 100 μg/mL de ampicilina y cultivar a 37 °C durante 16 h con agitación a 250 rpm. A continuación, extraiga el plásmido, vector-tag-K-bZIP, mediante un kit de extracción de plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
2. Genere el bacmid recombinante que alberga la etiqueta K-bZIP mediante la transformación del vector etiqueta K-bZIP en células competentes de E. coli "B" (ver Tabla de Materiales).
   1. Mezcle 0,2 μg de plásmido vector-tag-K-bZIP y 100 μL de E competente. coli células "B" en un tubo de 1,5 mL y se ponen en hielo durante 30 min. Incubar el tubo en un baño de agua a 42 °C durante 45 s e inmediatamente poner el tubo en hielo durante 3 min.
   2. Añadir 900 μL de medio S.O.C. en el tubo e incubar a 37 °C durante 4 h con rotación a 50 rpm. A continuación, tome 10 μL del medio y agregue 50 μL adicionales de medio S.O.C. para esparcir en placas de agar LB que contengan 50 μg/mL de kanamicina, 7 μg/mL de gentamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 100 μg/mL de sustrato de galactosidasa y 40 μg/mL de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), e incubar las placas durante 48 h a 37 °C.
   3. Inocular una colonia blanca en un medio LB de 5 mL que contenga 50 μg/mL de kanamicina, 7 μg/mL de gentamicina y 10 μg/mL de tetraciclina. Incubar a 37 °C con agitación a 250 rpm durante 16 h.
   4. Aislar el ADN bacmid recombinante que alberga la marca-K-bZIP, cuantificar y volver a suspender a una concentración de 1 μg/μL.
3. Genere baculovirus recombinantes que expresen tag-K-bZIP mediante la transfección de 1 μg de ADN bacmid recombinante que contenga tag-K-bZIP en células Sf9 en un pocillo de una placa de 6 pocillos.
   1. Siembre 2 x 10⁶ células Sf9 (ver Tabla de Materiales) en 2 mL de Medio para Insectos de Grace suministrado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de gentamicina en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, luego incube a 27 °C durante 1 h.
   2. Mantener un cultivo de fase logarítmica de células Sf9 en el medio para insectos de Grace suministrado con 10% de FBS, 1% de gentamicina y 1% de detergente C (ver Tabla de Materiales) a 27 °C en suspensión orbital a 140 rpm. Recuento de células con hemocitómetro y tinción con azul de tripano; La viabilidad celular debe superar el 95%. Mantenga las células utilizando una proporción de subcultivo de 1:3 cada 2-3 días (densidad mínima ~0,5 x 10⁶ células/mL).
   3. Agregue 2 μL de ADN de bacmid (1 μg/μL) y 98 μL de medio sérico reducido (ver Tabla de Materiales) en un tubo de 2 mL. A continuación, añada 4 μL de reactivo de transfección (consulte la tabla de materiales) al tubo y mezcle bien. Incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
   4. Añadir esta mezcla de transfección (104 μL) en cada pocillo e incubar a 27 °C durante 12-16 h.
   5. Retire los medios agotados con una aspiración suave y reemplácelos con 2 mL de Grace's Insect Medium fresco suministrado con 10% de FBS y 1% de gentamicina. Las células Sf9 se adhieren sin apretar a la superficie de la placa y no se alteran con una aspiración suave.
4. Recoja baculovirus recombinante después de la transfección y amplifique el baculovirus para obtener existencias de alto título (P1) para experimentos posteriores.
   1. 72 h después de cambiar el medio, raspe las células Sf9 con un elevador de células estéril, recoja el sobrenadante de cada pocillo individual en un tubo de 1,5 mL y vórtice durante 10 s.
   2. Centrifugar a 4 °C durante 3 min a 150 x g. Recoja el sobrenadante como baculovirus P0 y alícuota en tubos de 1,5 mL (1 mL de baculovirus en cada tubo). Conservar a -80 °C.
   3. Siembre 1 x 10⁷ células Sf9 en 10 mL de medio para insectos Grace's suministrado con 10% de FBS y 1% de gentamicina en una placa de Petri de 10 cm e incube a 27 °C durante 1 h.
   4. Para la amplificación de baculovirus recombinantes que expresan tag-K-bZIP, añadir 0,5 mL de baculovirus P0 a las células Sf9 sembradas e incubar a 27 °C durante 48 h.
   5. Recoja el sobrenadante como baculovirus P1 en un tubo de 15 ml y almacene a 4 °C durante un máximo de 1 mes.

2. Purificación de K-bZIP

1. Mantener un cultivo de fase logarítmica de células Sf9 en el medio para insectos de Grace suministrado con 10% de FBS, 1% de gentamicina y 1% de detergente C a 27 °C en suspensión orbital a 140 rpm como se describe en el paso 1.3.2.
2. El día de la transducción, agregue 1 mL de sobrenadante (P1) que contiene baculovirus en 250 mL de células Sf9 con una densidad de 2 x 10⁶ células/mL.
3. Incubar las células Sf9 durante 72 h a 27 °C en un agitador orbital con agitación a 140 rpm, y luego recoger por centrifugación a 2.740 x g durante 15 min a 4 °C.
4. Eliminar el sobrenadante y los gránulos de células lisadas en tampón de lisis de 10 mL (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1% de detergente A (ver Tabla de Materiales), 2% de glicerol, cóctel de inhibidores de proteasa) y girar a 50 rpm utilizando un mezclador de suspensión a 4 °C durante 30 min.
5. Centrifugar el lisado celular a 15.000 x g durante 15 min para recoger el sobrenadante.
6. Para purificar el tag-K-bZIP, incube los lisados celulares (10 mL) con 50 μL de perlas magnéticas marcadas con anticuerpos en tubos de polipropileno de 14 mL, y gírelo a 50 rpm durante 3 h a 4 °C utilizando un mezclador de suspensión. Después de la captura de proteínas, granule las perlas a una centrifugación de 800 x g durante 30 s a 4 °C. Retire la mayor parte del sobrenadante, vuelva a suspender las perlas en el volumen residual de aproximadamente 1 ml y transfiéralas a un tubo de 1,5 ml para el lavado.
7. Lave la proteína capturada colocando el tubo que contiene las perlas en un soporte magnético y retire el sobrenadante una vez que las perlas magnéticas se hayan adherido completamente al costado del tubo.
8. Lave las perlas con tampón de lisis cuatro veces.
   1. Agregue 1 mL de tampón de lisis en tubos de 1,5 mL e invierta los tubos 10 veces. Coloque el tubo de 1,5 ml en un soporte magnético y retire el sobrenadante como se describe en el punto 2.7.
   2. Repite el paso anterior otras 3 veces.
9. Lave las perlas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) una vez.
   1. Agregue 1 mL de PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 8 mM de Na₂HPO₄, 1,5 mM de KH₂PO₄) en tubos de 1,5 mL e invierta los tubos 10 veces.
   2. Coloque el tubo de 1,5 ml en un soporte magnético y, a continuación, retire el sobrenadante.
10. Eluir la proteína tag-K-bZIP de las perlas magnéticas marcadas con anticuerpos añadiendo 100 μL de octapéptido de 150 μg/mL diluido en PBS en un tubo de 1,5 mL. Gire el tubo durante 10 minutos a 50 rpm mediante un mezclador de suspensión a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a colocar el tubo en el soporte magnético y recoja el sobrenadante que contiene K-bZIP en un tubo limpio de 1,5 ml.
11. Analice 1-5 μL purificada de proteína tag-K-bZIP mediante SDS-PAGE seguida de tinción con azul de Coomassie. Cargue muestras de 2 μg, 1 μg y 0,5 μg de albúmina sérica bovina (BSA) en el mismo gel y utilícelo para la cuantificación con un programa de procesamiento de imágenes, como ImageJ. Estime la concentración de K-bZIP en comparación con los estándares BSA.
12. El K-bZIP purificado ya está listo para ser utilizado en cada ensayo de SUMOilación. Diluir el K-bZIP en PBS hasta una concentración final de 100 ng/μL y almacenar en pequeñas alícuotas a -80 °C.

3. Ensayo de SUMOilación

1. Añadir 3 μL de 100 ng/μL de tag-K-bZIP purificado a la mezcla maestra de cada reacción de SUMOilación in vitro. Los componentes de la mezcla maestra contienen 1 μL de tampón proteico, 1x tampón de SUMOilación, 0,5 μL de proteína p53 (0,5 mg/mL), 25 nM de enzima activadora E1 (conc. stock: 1 μM), 50 nM de enzima conjugadora E2 (conc. stock: 10 μM) y 250 nM de cada uno de los péptidos SUMO (SUMO-1, SUMO-2 o SUMO-3; conc. stock: 5 μM) hasta un volumen final de 17 μL.
2. Mezcle suavemente el contenido e incube la reacción a 30 °C durante 3 h. Detenga la reacción añadiendo 20 μL de tampón de carga 2x SDS-PAGE (100 mM de Tris-HCL pH 6,8, 4% de dodecil sulfato de sodio, 0,2% (p/v) de azul de bromofenol, 20% (v/v) de glicerol y 200 mM de β-mercaptoetanol) y desnaturalice las muestras a 95 °C durante 5 min.
3. Separe las muestras en SDS-PAGE, transfiera las proteínas separadas a la membrana de PVDF mediante el uso de un aparato de transferencia electroforética semiseco y analice mediante Western blot utilizando el anticuerpo anti-p53.
   1. Configure el aparato de gel y cargue 20 μL de muestra en los pocillos de gel.
   2. Ejecute el gel al 10% en una corriente constante a 80 V durante unos 120 minutos (hasta que la banda de tinte llegue al fondo del gel). Una vez finalizada la electroforesis, apague la fuente de alimentación.
   3. Desconecte el aparato de gel y los casetes de gel para extraer el gel y haga flotar el gel en un tampón de transferencia semiseco (48 mM de Tris-HCl, 39 mM de glicina, 20% de metanol) durante 5 min.
   4. Tome otro recipiente y remoje la membrana de PVDF en metanol durante 1 minuto. Luego, saque el PVDF del metanol y colóquelo en un tampón de transferencia semiseco. Agite suavemente la membrana durante 5 min.
   5. Retire la cubierta de seguridad del aparato electroforético semiseco.
   6. Humedezca previamente el papel de filtro y prepare un sándwich de gel en el ánodo de platino inferior de la siguiente manera: papel de filtro, membrana de PVDF, gel y papel de filtro.
   7. Asegure la placa del cátodo y la cubierta de seguridad, luego haga funcionar la transferencia a una corriente constante de 15 V durante 90 minutos. Apague la fuente de alimentación, desconecte el aparato semiseco y saque la membrana de PVDF.
   8. Bloquee la membrana de PVDF con tampón bloqueante (5% de leche desnatada en tampón TBST (137 mM de NaCl2, 20 mM de Tris-HCl, 0,1% de detergente B (ver Tabla de Materiales), pH 7,6)) a temperatura ambiente durante 1 h con agitación de 30 rpm mediante agitador orbital.
   9. Hibridar la membrana de PVDF con anticuerpo anti-p53 diluido (1:1.000) en tampón de bloqueo durante 12-16 h a 4 °C con agitación a 30 rpm utilizando un mezclador de suspensión.
   10. Saque la membrana de PVDF en un recipiente y colóquela en TBST. Enjuague la membrana de PVDF con TBST dos veces más.
   11. Remojar la membrana de PVDF en TBST durante 30 minutos con agitación a 45 rpm mediante agitador orbital.
   12. Hibridar la membrana de PVDF con anticuerpo anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluido (1:4.000) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente con agitación a 30 rpm utilizando un mezclador de suspensión.
   13. Lave la membrana de PVDF con TBST 3 veces como se describe en el paso 3.4.10.
   14. Remoje la membrana de PVDF en TBST durante 30 minutos con agitación a 45 rpm usando un mezclador de suspensión. Retire el TBST y añada PBS para conservar la membrana de PVDF a 4 °C durante un máximo de 12 h.
   15. Mezcle el reactivo 1 y 2 (1:1) del sustrato quimioluminiscente mejorado (sustrato ECL) (consulte la tabla de materiales). Retire la membrana de PVDF del PBS, seque brevemente con una toalla de papel o un limpiador ligero para absorber el exceso de humedad e inmediatamente agregue 400 μL de reactivo ECL a la superficie de cada membrana durante 3-5 minutos. Elimine el exceso de reactivo ECL mediante un secado breve, pero no permita que la membrana se seque por completo.
   16. Exponga la mancha con un sistema de imágenes de luminiscencia o una película de autorradiografía.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
pFastBac	Invitrogen	10359-016	Vector Baculovirus de Doble Expresión
Vector pCR2.1-TOPO	Invitrogen		Vector de producto PCR
célula competente E. coli DH5α	Biotecnología de levadura	FYE678-80VL	células competentes de E. coli A
E. coli DH10Bac	Invitrogen	10359-016	células B de E. coli competentes
FugeneHD	Roche	4709705001	reactivo de transfección
Opti-MEM	Gibco	31985062	Medios séricos reducidos
T4 Ligasa	NUEVA INGLATERRA BioLabs	M0202S
CpoI (RsrII)	Termo Científico	ER0741
Bluo-gal	Termo Científico	B1690	Sustrato de galactosidasa
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Medio insecto de Grace	Gibco	11605094
Suero Fetal Bovino	Gibco	10082147
gentamicina	Termo Fisher	15750060
ampicilina	Sigma-Aldrich	A9393-25G
kanamicina	Sigma-Aldrich	K0254-20ML
gentamicina	Gibco	15710-064
tetraciclina	Sigma-Aldrich	87128-25G
Caldo LB	Merk	1.10285.0500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-5KG
Kcl	Merk	1.04936.1000
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136-500G
KH2PO4	J.T.Baker	3246-01
Dodecil sulfato de sodio	Merk	1.13760.1000
β-mercaptoetanol	Bio-Rad	161-0710
TRIS (Base)	J.T.Baker	4109-06
Leche descremada	Fonterra
glicerol	J.T.Baker	2136-01
Tritón X-100	Amresco	0694-1L	detergente A
Preadolescente 20	Amresco	0777-500ML	detergente B
Solución de Poloxamer 188	Sigma-Aldrich	P5556-100ML	detergente C
Tableta de cóctel inhibidor de proteasa	Roche	04 693 132 001
3x Péptido bandera	sigma	F4799
anti-FLAG m2 Perlas magnéticas	Sigma-Aldrich	M8823	perlas magnéticas marcadas con anticuerpos
Kit SUMOlink SUMO-1	Motivo activo	40120	Protocolo estándar de SUMOilación
Kit SUMOlink SUMO-2/3	Motivo activo	40220	Protocolo estándar de SUMOilación
Kit de extracción de gel QIAquick	QIAGEN	28704
Mini kit de plásmido QIAGEN	QIAGEN	12123	kit de extracción de plásmidos
Tubos de polipropileno	halcón	352059
placa de Petri	halcón	351029
Elevador de células	Corning	CNG3008
Sugerencia de carga	Biociencia de Sorenson	28480
PVDF	PerkinElmer	NEF1002
Papel de filtro secante	Bio-Rad	1703932
Mini aparato de gel de losa (Bio-Rad Mini Protean II Cell)	Bio-Rad	1658001 EDU
Celda de transferencia electroforética semiseca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940
Pierce ECL Western Blotting	termo	32106	Reactivo ECL
mezclador de suspensión	Instrumentos de laboratorio Digisystem Inc.	SM-3000
agitador orbital	Kansin instruments Co.	OS701
ImageQuant LAS 4000	GE Cuidado de la Salud	28955810
generador de imágenes biomoleculares	GE Cuidado de la Salud	28955810
SF9	Termo Científico	B82501
Anticuerpo anti-p53	Señalización celular	#9282
Anticuerpo anti-conejo	GE Cuidado de la Salud	NA934-1ML