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Artículo de método
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8 de julio de 2025
Fuente: Yang, W. S. et al., Ensayo de SUMOilación in vitro para estudiar la actividad de la ligasa SUMO E3. J. Vis. Exp. (2018)
Este video demuestra el método in vitro para la SUMOilación de proteínas de sustrato utilizando una cascada de enzimas secuencial. Además, el estado SUMOilado de la proteína se identifica mediante la técnica de electroforesis e inmunotransferencia.
1. Preparación de construcciones de expresión de Baculovirus
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | Vector Baculovirus de Doble Expresión |
| Vector pCR2.1-TOPO | Invitrogen | Vector de producto PCR | |
| célula competente E. coli DH5α | Biotecnología de levadura | FYE678-80VL | células competentes de E. coli A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | células B de E. coli competentes |
| FugeneHD | Roche | 4709705001 | reactivo de transfección |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | Medios séricos reducidos |
| T4 Ligasa | NUEVA INGLATERRA BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Termo Científico | ER0741 | |
| Bluo-gal | Termo Científico | B1690 | Sustrato de galactosidasa |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Medio insecto de Grace | Gibco | 11605094 | |
| Suero Fetal Bovino | Gibco | 10082147 | |
| gentamicina | Termo Fisher | 15750060 | |
| ampicilina | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| kanamicina | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicina | Gibco | 15710-064 | |
| tetraciclina | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| Caldo LB | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| Kcl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| Dodecil sulfato de sodio | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoetanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Leche descremada | Fonterra | ||
| glicerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Tritón X-100 | Amresco | 0694-1L | detergente A |
| Preadolescente 20 | Amresco | 0777-500ML | detergente B |
| Solución de Poloxamer 188 | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergente C |
| Tableta de cóctel inhibidor de proteasa | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Péptido bandera | sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Perlas magnéticas | Sigma-Aldrich | M8823 | perlas magnéticas marcadas con anticuerpos |
| Kit SUMOlink SUMO-1 | Motivo activo | 40120 | Protocolo estándar de SUMOilación |
| Kit SUMOlink SUMO-2/3 | Motivo activo | 40220 | Protocolo estándar de SUMOilación |
| Kit de extracción de gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | |
| Mini kit de plásmido QIAGEN | QIAGEN | 12123 | kit de extracción de plásmidos |
| Tubos de polipropileno | halcón | 352059 | |
| placa de Petri | halcón | 351029 | |
| Elevador de células | Corning | CNG3008 | |
| Sugerencia de carga | Biociencia de Sorenson | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Papel de filtro secante | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini aparato de gel de losa (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Celda de transferencia electroforética semiseca Trans-Blot SD | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | termo | 32106 | Reactivo ECL |
| mezclador de suspensión | Instrumentos de laboratorio Digisystem Inc. | SM-3000 | |
| agitador orbital | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 | GE Cuidado de la Salud | 28955810 | |
| generador de imágenes biomoleculares | GE Cuidado de la Salud | 28955810 | |
| SF9 | Termo Científico | B82501 | |
| Anticuerpo anti-p53 | Señalización celular | #9282 | |
| Anticuerpo anti-conejo | GE Cuidado de la Salud | NA934-1ML |
