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1. Preparación del reactivo
- Prepare el medio DMEM de baja fluorescencia para ensayos utilizando un lector de fluorescencia de microplacas. Mezcla 25 mM de glucosa, 0,4 mM de glicina, 0,4 mM de arginina, 0,2 mM de cisteína, 4,0 mM de glutamina, 0,2 mM de histidina, 0,8 mM de isoleucina, 0,8 mM de leucina, 0,8 mM de lisina, 0,2 mM de metionina, 0,4 mM de fenilalanina, 0,4 mM de serina, 0,8 mM de treonina, 0,078 mM de triptófano, 0,4 mM de tirosina, 0,8 mM de valina, 1,8 mM de CaCl2, 0,81 mM de MgSO4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO3, 110 mM NaCl, 0,9 mM NaH2PO4. Ajuste el pH de la solución usando HCl o NaOH a pH 7.4. Esterilizar el medio mediante filtración.
nota: Este medio contiene componentes del medio DMEM estándar con alto contenido de glucosa, excepto que se omiten Fe(NO3)3, vitaminas y rojo de fenol. El rojo de fenol, la riboflavina y el piridoxal en un medio de cultivo DMEM regular interfieren significativamente con la detección de la señal de fluorescencia. El medio de cultivo sin esos componentes es crucial para el éxito de la obtención de imágenes de GFP de células vivas. El medio es estable durante 12 meses cuando se almacena refrigerado.
2. Ensayo de degradación en tiempo real de NLS-luciferasa-GFP utilizando un lector de microplacas de fluorescencia
- Siembre aproximadamente 1 x 104 células HeLa en placas de cultivo de tejido negras de 96 pocillos con fondo transparente. Después del cultivo O/N, se alcanza una confluencia del 50-70% en el momento de la transfección.
NOTA: Se siembran 60 μl de medio que contiene células HeLa completamente suspendidas directamente en cada pocillo. No agregue medio adicional o placa de roca de un lado a otro después de la siembra, de lo contrario, las celdas pueden distribuirse de manera desigual.
- Transfecte las células HeLa con 0,05-0,1 μg de plásmido NLS-luciferasa-GFP/pRK5 en cada pocillo utilizando un reactivo de transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Hacer una mezcla maestra de transfección que contenga ADN y reactivo de transfección y alícuota para cada pocillo. Tres pocillos con células no están transfectados con ADN, que sirve como control para la señal de fluorescencia de fondo para cada condición de tratamiento.
nota: Una forma alternativa de reducir la variación de la transfección es transfectar las células antes de sembrarlas. Sin embargo, una gran parte de las células transfectadas con proteínas mal plegadas no se adhieren o muestran una viabilidad reducida utilizando este método. Es probable que algunas células no soporten el estrés causado por la digestión de la tripsina al expresar proteínas tóxicas mal plegadas. Como resultado, la señal fluorescente general se reduce significativamente.
- 20-24 horas después de la transfección, examine las células vivas bajo un microscopio fluorescente invertido para detectar la expresión de GFP con una longitud de onda de excitación de 450-490 nm.
- Retire el medio por aspiración endouterina. Agregue aproximadamente 200 μl 1x PBS a cada pocillo y luego aspire para eliminar la cantidad residual de medio DMEM.
- Añadir 60 μl de medio DMEM de baja fluorescencia con 5% de FBS y 50 μg/ml de CHX. Para examinar la degradación proteasómica, incluya el inhibidor del proteasoma MG132 (10 μM) adicional en un conjunto de muestras. Establecer triplicado de pocillos para cada tratamiento/condición.
nota: El tratamiento con MG132 se incluye como control de la degradación proteasómica porque es crucial para descartar otros factores que pueden causar la caída de la señal de fluorescencia, incluida la muerte celular y el enfriamiento de la fluorescencia.
- Mida la señal de fluorescencia de GFP inmediatamente en un lector de placas fluorescentes después de agregar CHX.
nota: Los ajustes de medición del software se muestran en la Tabla 1.
- Lea la placa cada hora durante un máximo de 8 a 10 horas. Después de leer, devuelva la placa a la incubadora de cultivos celulares.
- Exporte los datos como un archivo de hoja de cálculo. Utilice el valor medio de las lecturas múltiples para cada pocillo y la intensidad de fluorescencia. Normalice los valores de cada punto de datos a los valores medios de Tiempo 0 en los grupos respectivos. Traza la intensidad de fluorescencia normalizada a lo largo del tiempo como se muestra en la Figura 1A y 1B, y en la Figura 2, paneles derecho.
- Realizar análisis estadísticos de las tasas de degradación entre dos condiciones utilizando ANOVA de dos factores con medidas repetidas.
nota: En este análisis, la "intensidad de fluorescencia" es la variable dependiente, mientras que las "condiciones de tratamiento" y el "tiempo" son los dos factores. En lugar de comparar los datos en puntos temporales individuales, el ANOVA de dos factores con medidas repetidas analiza la diferencia entre los dos grupos de tratamiento durante todo el curso de tiempo.
Tabla 1: Ajustes de medición en el lector de microplacas de fluorescencia.
| Fichero de definición de placa | GRE96fb |
| Modo de medición | Fondo de intensidad de fluorescencia |
| Longitud de onda | Longitud de onda de excitación | 485 nm |
| Ancho de banda de excitación | 9 nm |
| Longitud de onda de emisión | 535 nm |
| Anchura de banda de emisión | 20 nm |
| Número de destellos | 5 |
| Ganancia | Manual 200 |
| Tiempo de integración | 20 μs |
| Múltiples lecturas por pozo | tipo | Círculo (relleno) |
| tamaño | 5×5 |
| frontera | 400 μm |
