Ensayo Bioreportero: Una técnica sensible que utiliza un sistema reportero bioluminiscente para detectar anticuerpos contra el SARS-CoV-2

Resumen

Fuente: Rezaei, R. et al., Detección de anticuerpos de dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2 utilizando un Bioreporter basado en HiBiT. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, mostramos el ensayo basado en el sistema bioreportero HiBit-RBD para detectar anticuerpos neutralizantes contra el SARS-CoV-2. Este sistema se dirige al dominio RBD viral mediante el uso de un sistema reportero bioluminiscente que contiene HiBiT fusionado con el dominio RBD.

Protocolo

1. Detección de anticuerpos anti-RBD con un ensayo rápido y sensible

1. Ensayo de detección de anticuerpos HiBiT-RBD
   1. Prepare el HiBiT-RBD bioreportero.
      nota: Se recomienda utilizar el sobrenadante para el siguiente ensayo, ya que es más sencillo de recoger y contiene la versión glicosilada madura de la proteína. Además, el lisado tiene varias otras proteínas que podrían interferir con la interacción HiBiT-RBD-anticuerpo.
   2. Combine 50 μL del sobrenadante que contiene HiBiT-RBD con 1 μg del anticuerpo comercial SARS-CoV-2-RBD en un microtubo de 1,5 mL. Añadir 20 μL de proteína de unión a inmunoglobulinas (proteína G) a la solución. Aumente el volumen total a 300 μL agregando PBS.
      nota: El volumen total de la mezcla puede reducirse a 150 μL. No se recomiendan volúmenes totales inferiores, ya que podrían dar lugar a una mezcla inadecuada de anticuerpos con el bioreportero.
   3. Incubar el/los tubo/s en un agitador de tubos o rotador durante 30 min. Centrifugar a 12.000 x g durante 30 s, desechar el sobrenadante y lavar con PBS. Repita el proceso tres veces para eliminar el HiBiT-RBD libre. Vuelva a suspender en 50 μL de PBS y transfiéralo a una placa de 96 pocillos.
   4. Agregue 50 μL de 1x LgBiT y espere 5 min. A continuación, añade 50 μL de sustrato 1x NanoLuc. Lea inmediatamente la señal luminiscente con un luminómetro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lavadora magnética de mano Bio-Plex	Bio-Rad	171020100	dispositivo
Sistema de ensayo de luciferasa de doble glo	Promega	E2940	Kit de 100 mL
LgBiT	Promega	N3030	Kit de ensayo
Perlas magnéticas Pierce Protein G	Thermo Fisher Scientific	88848	Ensayo
Anticuerpo neutralizante de la espícula del SARS-CoV-2 (2019-nCoV), Mab de ratón	SinoBiológico	40592-MM57	Ensayo
Lector de microplacas Synergy Mx	BioTek		Luminómetro lector de placas de 96 pocillos