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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
En la Figura 1 se proporciona una descripción general esquemática del protocolo de ensayo.
1. Preparación inicial
- Para la evaluación en ovejas: recolectar sangre en tubos activadores de coágulos separadores de suero de 8 mL (ver Tabla de Materiales), dejar la muestra de sangre a temperatura ambiente (RT) durante 20-30 min y, posteriormente, centrifugar a 2.100 x g durante 15 min. El sobrenadante transparente que se forma en la parte superior de las trompas es el suero. Alicucuota la fase acuosa clara en tubos de microcentrífuga y almacenar a -80 °C.
nota: El suero a -80 °C permanece estable durante ~5 años. La sangre se extrajo de la vena carótida utilizando una aguja de 16 G (punta cortada) y una jeringa de animales conscientes.
- Calentar el suero fetal bovino inactivado (FBS) colocándolo en un baño de agua a 56 °C durante 30 min, y agitar de forma intermitente. Para mayor precisión, coloque un termómetro en una segunda botella que contenga un volumen equivalente de agua y agréguelo al baño de calor al mismo tiempo que la botella FBS. Comience a cronometrar cuando el termómetro alcance los 56 °C.
- Emplee la técnica aséptica adecuada y la práctica de cultivo celular para todos los pasos posteriores realizados en la campana de cultivo celular. Rocíe etanol al 70% en todos los objetos y la campana antes de usar y limpie con hipoclorito de sodio al 1% al finalizar.
- Completa el Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco combinando alta glucosa (4,5 g/L), DMEM (89%) con FBS inactivado por calor (10%) y penicilina, estreptomicina (1%). Combine y filtre utilizando un sistema de filtración al vacío estéril (tamaño de poro de 0,22 μm, membrana de polietersulfona) (consulte la tabla de materiales). Guarde el DMEM completo envuelto en papel de aluminio a 4 °C.
- Establecer celdas HT1080 (ver Tabla de Materiales) y pasar en un matraz cuadrado de75 cm2. Cree varias existencias congeladas de celdas. No utilice celdas después de 20 pasadas, ya que las pasadas posteriores pueden influir en los resultados del ensayo.
2. Día 1 - Recubrimiento de las células
- Pasa las celdas HT1080 cuando alcanzan ~80% de confluencia.
- Precalentar DMEM completo (preparado en el paso 1.4), tripsina-EDTA al 0,05% y solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x a 37 °C en un baño de agua. Retire el medio de crecimiento de las células transitadas mediante un sistema de aspiración.
nota: Todas las aspiraciones de este protocolo utilizan un sistema de vacío con un tubo conectado a una pipeta serológica estéril de 5 mL.
- Lave las células con 10 mL de PBS precalentado (37 °C) 1x y tripsinícelas durante 3-4 min con 4 mL de tripsina-EDTA precalentado al 0,05% para separar las células del matraz.
- Inactive la tripsina añadiendo 6 mL de DMEM completo precalentado y pipetee las células en un tubo de 50 mL. Calcular el número y la concentración de células viables utilizando un hemocitómetro y el método de exclusión de azul de tripano.
- Diluir las células hasta una concentración de 1 x 105 células/mL en DMEM completo precalentado. Siembre 100 μL de células/pocillo en placas transparentes de fondo plano de 96 pocillos (1 x 104 celdas por pocillo). Incubar la placa a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2) durante la noche durante 16-22 h.
3. Día 2 - Infectando las células
- Retire la/s placa/s de la incubadora y use un microscopio óptico para confirmar que las células estén dispersas uniformemente dentro de los pocillos y que la confluencia sea de ~50%. Si las células no están dentro de un rango de confluencia del 45% al 55%, repita el protocolo del "Día 1" y ajuste la concentración celular inicial en consecuencia.
- Genere diluciones en serie de las muestras de suero de interés en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL utilizando DMEM completo precalentado como diluyente. La Tabla 1 muestra la generación de una cascada de dilución para muestras por triplicado.
- Para realizar el ensayo por triplicado, prepare una solución de trabajo de 7,5 x106 6 genomas vectoriales (vg)/μL de AAV6-hPLAP (ver Tabla de Materiales) diluyendo una solución madre de virus en 1x PBS.
- Añadir 66 μL de la solución de trabajo de virus 7,5 x 106 vg/μL a cada tubo que contenga 264 μL de dilución de suero/medio (330 μL de volumen total/dilución, ver Tabla 1).
nota: Se trata de un ensayo robusto que no requiere condiciones de cultivo perfectas. Sin embargo, para cuantificar con precisión y garantizar que cada ensayo sea confiable, es necesario incluir lo siguiente: (1) un control solo de virus y medios, (2) un control solo de medios y (3) una muestra de control positivo de NAb en todas las placas en las mismas condiciones experimentales. El volumen descrito (330 μL) representa muestras triplicadas + 10% de la mezcla de suero y virus. Se recomienda encarecidamente la realización de réplicas para la determinación precisa de la actividad neutralizante.
- Mezclar las diluciones de virus/suero mediante pipeteo y colocar los tubos que contienen las mezclas de virus/suero en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 min para permitir que se produzca una posible neutralización.
- Pipetear 100 μL de la mezcla de virus/suero en cada pocillo en la placa de 96 pocillos que contiene 1 x 104 células/pocillo por cada dilución.
nota: Esto generará una concentración viral final de 15k virus/multiplicidad celular de infección (MOI) en cada pocillo. La Tabla 2 proporciona un ejemplo de diseño de placa de muestra de 96 pocillos para evaluar muestras a una dilución de 1/512.
- Envuelva la placa de 96 pocillos que contiene las células, el suero y el AAV-hPLAP en papel de aluminio y colóquela en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante la noche durante 16-24 h para permitir la entrada de AAV en las células.
4. Día 3 - Fijación y adición de sustrato a las células
- Precaliente una alícuota de 1x PBS a 37 °C (~25 mL/placa de 96 pocillos). Enfríe alícuotas separadas de PBS (~25 mL/placa de 96 pocillos) y H2O de doble destilación (DDW, ~25 mL/placa de 96 pocillos) a 4 °C. Disuelva un pellet de BCIP/NBT (consulte la Tabla de materiales) en 10 mL de DDW en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL mediante vórtice (10 mL son suficientes para 2 placas de 96 pocillos).
- Aspire los medios de los pocillos de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta serológica o similar conectada a un sistema de aspiración basado en succión o a una aspiradora de campana extractora. Coloque suavemente la punta de la pipeta serológica en el pocillo y retire el medio teniendo cuidado de no alterar las células adheridas.
- Agregue 50 μL de RT 4% PFA a cada pocillo con una pipeta. Envuelva el plato en papel de aluminio y déjelo en RT durante 10 minutos para fijar las celdas.
cautela: El paraformaldehído (PFA) es un probable carcinógeno y es tóxico por contacto con la piel o los ojos o inhalación. Manéjelo en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado, así como una mascarilla. Prepare PFA fresco al 4% diluido en PBS (se requieren ~ 7 mL por placa de 96 pocillos).
- Lavar y aspirar las células con 200 μL de RT 1x PBS. Repita este paso dos veces.
nota: Una pipeta multicanal es una opción eficiente para los pasos de pipeteo.
- Pipetear 200 μL de PBS precalentado en cada pocillo, envolver la placa en papel de aluminio e incubar a 65 °C durante 90 min para desnaturalizar la actividad endógena de la fosfatasa alcalina.
- Aspirar pocillos y lavar las celdas con 200 μL de PBS frío (4 °C). Aspirar de nuevo, lavar en 200 μl de DDW frío y aspirar de nuevo.
- Pipetear 50 μL del BCIP/NBT disuelto (preparado en el paso 4.1) en cada pocillo.
- Envuelva la placa en papel de aluminio e incube a RT durante 2-24 h.
nota: Ser consistente con el tiempo de incubación entre corridas; La flexibilidad de tiempo permite a los usuarios fotografiar pozos el día 3 o el día siguiente.
- Con una cámara de microscopio óptico, tome fotos de cada pocillo con una lente de objetivo 4x, asegurándose de que la misma exposición, equilibrio de blancos y ajustes de luz se utilicen de manera consistente para todos los ensayos realizados.
- Coloque cada pozo de manera idéntica y asegúrese de que los bordes del pozo no sean visibles en las fotos. Guarde las fotos en formato TIF o similar.
nota: Los ajustes específicos variarán entre los microscopios, pero la cuantificación será más eficaz si la iluminación de fondo es alta y constante en todos los pocillos (Figura 1B).
Tabla 1: Volúmenes de suero y diluyente necesarios para generar diluciones seriadas de suero por triplicado.
| Etiqueta en cascada de dilución | dilución | 3 x muestra (240 μL) + 10% de volumen de tampón (24 μL) | Proporción de suero:medio |
| Dilución 1 (D1) | 1/2 | 264 μL de suero 264 μL de medios | 50:50 |
| Dilución 2 (D2) | 1/4 | 264 μL D1 + 264 μL de medios | 25:75 |
| Dilución 3 (D3) | 1/8 | Medios de 264 μL D2 +264 μL | 12.5:87.5 |
| Dilución 4 (D4) | 1/16 | 264 μL D3 +264 μL medios | 6.25:93.75 |
| Dilución 5 (D5) | 1/32 | 264 μL D4 +264 μL medios | 3.13:96.87 |
| Dilución 6 (D6) | 1/64 | 264 μL D5 +264 μL medios | 1.56:98.44 |
| Dilución 7 (D7) | 1/128 | 264 μL D5 +264 μL medios | 0.78:99.22 |
| Dilución 8 (D8) | 1/256 | 264 μL D5 +264 μL medios | 0.39:99.61 |
| Dilución 9 (D9) | 1/512 | 264 μL D7 + 264 μL de medios | 0.2:99.8 |
| Dilución 10 (D10) | 1/2048 | 132 μL D8 + 396 μL de medios | 0.05:99.95 |
| Dilución 11 (D11) | 1/8192 | 132 μL D9 + 396 μL medios | 0.01:99.99 |
| Dilución 12 (D12) | 1/32768 | 132 μL D10 + 396 μL medios | 0.003:99.997 |
Tabla 2: Ejemplo de disposición de placa de 96 pocillos para evaluar muestras de suero ingenuas en diluciones que van desde 1/2 hasta 1/512. Se incorporan diluciones más altas en el ensayo si se evalúa una muestra que se sabe que es positiva para AAV NAbs (muestras posteriores a la administración) o si se requiere un título más alto. MO (-C): control de solo medios. VO (+C): Control de virus y solo medios. mAb: Anticuerpo monoclonal contra AAV (control positivo de NAb).
| Muestra de suero #1 | Muestra de suero #2 | Muestra de suero #3 | Mono AB (mAB), controles y muestras extra |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 1/2 | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab | 50 ng
Mab |
| B | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 1/4 | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab | 5 ng
Mab |
| C | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 1/8 | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab | 0.5 ng
Mab |
| D | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | 1/16 | MO (-C) | MO (-C) | MO (-C) |
| E | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | 1/32 | VO (+C) | VO (+C) | VO (+C) |
| F | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | 1/64 | Sample
#1
1/512 | Sample
#1
1/512 | Sample
#1
1/512 |
| G | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | 1/256 | Sample
#2
1/512 | Sample
#2
1/512 | Sample
#2
1/512 |
| H | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | 1/512 | Sample
#3
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