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1. Preparación del medio de crecimiento, solución de ofloxacina y reservas de células de E. coli
- Medio Luria-Bertani (LB) regular: Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de cloruro de sodio (NaCl) y 5 g/L de extracto de levadura en agua desionizada (DI). Esterilizar el medio mediante autoclave.
- Placas de agar LB: Añadir 10 g/L de triptona, 10 g/L de NaCl, 5 g/L de extracto de levadura y 15 g/L de agar en agua desionizada y esterilizar el medio en autoclave. A la temperatura deseada (~55 °C), vierta ~30 mL de medio de agar en placas cuadradas (10 x 10 cm). Seque las placas y guárdelas a 4 °C.
- Medio LB modificado: Añadir 10 g/L de triptona y 5 g/L de extracto de levadura en agua desionizada. Esterilizar el medio mediante autoclave.
- Medio LB modificado que incluye un osmolito: Mezcle 2 veces el medio LB modificado con una solución de osmolito 2 veces en volúmenes iguales. Para preparar 2 medios LB modificados, agregue 20 g / L de triptona y 10 g / L de extracto de levadura en agua desionizada y esterilice en autoclave. Para preparar la solución de osmolito 2x, disuelva el osmolito de interés (2x cantidad) en agua desionizada y luego filtre la solución.
nota: El osmolito de interés y sus concentraciones pueden determinarse a partir de los ensayos de cribado de microarrays de fenotipo (véase el Protocolo 4). Sin embargo, el osmolito analizado y la concentración 2x asociada se pueden ajustar en función de la naturaleza de la investigación. Por ejemplo, para estudiar el impacto del cloruro de sodio de 1 mM, una solución de osmolito 2x sería una solución de cloruro de sodio de 2 mM.
- Solución madre de ofloxacina (5 mg/mL): Agregue 5 mg de sal de ofloxacina (OFX) en 1 mL de agua desionizada. Agregue 10 μL de hidróxido de sodio 10 M para aumentar la solubilidad de OFX en agua y luego esterilice la solución por filtro. Preparar las alícuotas y almacenar a -20 °C.
nota: El ofloxacino es un antibiótico quinolona que ha sido ampliamente utilizado tanto para células bacterianas en crecimiento como en no crecimiento14,21. La concentración inhibitoria mínima (CMI) de OFX para las células MG1655 de E. coli está dentro del rango de 0,039 a 0,078 μg/mL. Además, tenga en cuenta que otros antibióticos como la ampicilina y la kanamicina se usan comúnmente en la investigación persistente. La elección de los antibióticos depende de la naturaleza del estudio.
- Stock de células de E. coli MG1655: Inocular 2 mL de medio LB regular con una sola colonia en un tubo de ensayo de 14 mL (tapado a presión) y cultivar las células en un agitador orbital a 250 rpm y 37 °C. Cuando las células alcancen la fase estacionaria, mezcle 500 μL del cultivo celular con 500 μL de glicerol al 50% (estéril) en un vial criogénico y almacene a -80 °C.
2. Propagación de células para eliminar persistentes preexistentes
- Para preparar un cultivo nocturno, raspe una pequeña cantidad de células de un stock de células congeladas con una punta de pipeta estéril (no descongele el stock de células de glicerol) e inocule las células en 2 mL de medio LB modificado en un tubo de ensayo de 14 mL con tapa a presión. Cultivar las células en un agitador orbital a 250 rpm y 37 °C durante 12 h.
- Primera propagación
- Después de 12 h, transfiera 250 μL de cultivo durante la noche a 25 mL de medio LB modificado fresco en un matraz deflector de 250 mL cubierto con papel de aluminio estéril.
- Cultive el cultivo celular en un agitador orbital a 250 rpm y 37 °C hasta que las células alcancen la fase exponencial media (OD600 = 0,5).
- Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) utilizando un lector de microplacas cada 30 minutos.
- Segunda propagación
- A DO600 = 0,5, diluir 250 μL de cultivo celular del primer matraz en 25 mL de medio LB modificado fresco en un matraz deflector de 250 mL.
- Cultive el segundo cultivo celular en un agitador orbital a 250 rpm y 37 °C hasta OD600 = 0,5.
- Mida la densidad óptica cada 30 min.
nota: Un cultivo nocturno puede tener una cantidad significativa de células persistentes. El método de ciclo de dilución/crecimiento descrito anteriormente se puede utilizar para eliminar estos persistentes preexistentes antes de transferir las células a microarrays. Su eliminación puede validarse cuantificando los niveles persistentes de cultivos nocturnos con el ensayo descrito en el Protocolo 3.
3. Validando la eliminación de células persistentes preexistentes
- Después de la segunda propagación (ver paso 2.3), diluir 250 μL del cultivo celular (OD600 = 0,5) en 25 mL de medio LB modificado fresco en un matraz deflector de 250 mL.
nota: Para los controles, diluir 250 μl de cultivo nocturno (ver paso 2.1) en 25 mL de medio LB modificado fresco en un matraz deflector de 250 mL. Antes de transferir las células al matraz, se debe ajustar la densidad celular del cultivo nocturno en un medio LB fresco modificado para obtener OD600 = 0,5.
- Añadir 25 μL de solución madre OFX (5 mg/mL) en la suspensión celular y agitar suavemente el matraz para que el cultivo del ensayo sea homogéneo. La concentración final de OFX es de 5 μg/mL en el cultivo del ensayo.
- Incubar el cultivo de ensayo en un agitador orbital a 250 rpm y 37 °C.
- Cada hora durante el tratamiento (incluidas las 0 h, el punto de tiempo antes de añadir OFX al cultivo de ensayo), transfiera 1 mL del cultivo de ensayo del matraz a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Centrifugar el cultivo de ensayo en el tubo de microcentrífuga a 17.000 x g durante 3 min.
- Retire con cuidado 950 μL del sobrenadante sin alterar la pelletización de la célula.
- Añada 950 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el tubo de microcentrífuga.
- Repita los pasos de lavado 3.5-3.7 durante 3 veces en total hasta que la concentración de antibiótico esté por debajo de la concentración inhibitoria mínima (CMI).
- Después del lavado final, vuelva a suspender el pellet celular en 100 μL de solución de PBS, lo que da como resultado una muestra concentrada 10x.
- Tome 10 μL de la suspensión celular y dilúyala en serie seis veces en 90 μL de solución de PBS usando una placa inferior redonda de 96 pocillos.
- Localice 10 μL de suspensiones celulares diluidas en placas de agar fresco sin antibióticos. Para aumentar el límite de detección, coloque los 90 μL restantes de suspensión celular en una placa de agar nueva.
- Incubar las placas de agar a 37 °C durante 16 h y, a continuación, contar las unidades formadoras de colonias (UFC). Tenga en cuenta las tasas de dilución al calcular el número total de UFC en 1 ml de cultivo de ensayo. Las curvas de muerte se generan trazando los valores logarítmicos de las UFC con respecto a la duración del tratamiento con antibióticos.
nota: Un tratamiento de OFX de 6 h es suficiente para obtener una curva de muerte bifásica para las células de E. coli. El nivel persistente de células propagadas (medido por los recuentos de UFC a las 6 h) debe ser significativamente menor que el del cultivo nocturno. Los procedimientos descritos en los Protocolos 2 y 3 se pueden realizar con LB regular dependiendo del diseño de la investigación.
4. Cribado de placas de microarrays
- Preparación de cultivos celulares de microarrays
- Transfiera 250 μL de células de fase exponencial a 25 mL de medio LB modificado fresco en un tubo de centrífuga de 50 mL. Mezcle suavemente la suspensión celular para hacerla homogénea.
nota: Las células de fase exponencial (OD600 = 0,5) se obtienen a partir del segundo paso de propagación (véase el paso 2.3).
- Transfiera la suspensión celular diluida a un depósito estéril de 50 mL.
- Con una pipeta multicanal, transfiera 150 μL de la suspensión celular a cada pocillo de un microarray, es decir, una placa de 96 pocillos que contenga varios osmolitos.
nota: Los pozos que no tienen osmolitos sirven como controles.
- Cubra el microarray con una membrana de sellado permeable al gas.
- Incubar la placa en un agitador orbital a 37 °C y 250 rpm durante 24 h.
nota: En estos experimentos, se utilizaron placas disponibles comercialmente, como los micromatrices de fenotipos (PM-9 y PM-10) que incluyen una amplia gama de osmolitos, tampones de pH y otros productos químicos en estado seco a varias concentraciones. Estos microarrays están en formatos de placa de 96 pocillos de media área. Los volúmenes de cultivo deben ajustarse en función del tipo de placas que se utilicen. Los microarrays también se pueden generar manualmente.
- Preparación manual de placas de microarrays
- Transfiera 75 μL de soluciones de osmolito 2x a los pocillos de una placa de 96 pocillos de media área.
- Transfiera 500 μL de celdas de fase exponencial a 25 mL de medio LB modificado 2x en un tubo de centrífuga de 50 mL. Mezcle suavemente la suspensión celular para hacerla homogénea.
nota: La tasa de inoculación se ajustó para que fuera coherente con el protocolo de cribado de microarrays descrito en el punto 4.1.
- Agregue 75 μL de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de media área que contiene 2 soluciones de osmolitos.
- Incubar la placa en un agitador orbital a 37 °C y 250 rpm durante 24 h.
- Preparación de placas de ensayo persistentes
- Prepare 25 mL de medio LB modificado que contenga 5 μg/mL de OFX en un tubo de centrífuga de 50 mL y transfiera este medio a un depósito estéril.
- Transfiera 190 μL de medio LB modificado con OFX desde el depósito a cada pocillo de una placa genérica de fondo plano de 96 pocillos (placa de ensayo persistente) utilizando una pipeta multicanal.
- Retire el microarray del agitador (después de cultivar durante 24 h) y transfiera 10 μL de cultivos celulares del microarray a los pocillos de la placa de ensayo persistente, que contiene medio LB modificado con OFX.
- Tome 10 μL de suspensiones celulares de la placa de ensayo persistente y diluya en serie tres veces en 290 μL de solución de PBS utilizando una placa de 96 pocillos de fondo redondo y una pipeta multicanal.
- Después de la dilución en serie, coloque 10 μL de todas las suspensiones celulares diluidas en serie en placas de agar fresco sin antibióticos utilizando una pipeta multicanal.
- Incubar la placa de ensayo persistente (preparada en el paso 4.3.3) en un agitador orbital a 37 °C y 250 rpm durante 6 h después de cubrir la placa con una membrana de sellado permeable al gas.
- Después de 6 h de incubación en un agitador, extraiga la placa de ensayo persistente y repita los pasos 4.3.4-4.3.5.
- Incubar las placas de agar durante 16 h a 37 °C y, a continuación, contar las UFC. Los niveles de UFC antes y 6 h después del tratamiento antibiótico permiten calcular la fracción persistente en cada pocillo. Los recuentos de UFC antes del tratamiento con OFX también ayudan a evaluar los efectos de los osmolitos y sobre la viabilidad de E. coli.