1. Medición de la disminución de la proteostasis en el tejido muscular mediante el uso de animales que expresan poliglutamina
NOTA: Se pueden utilizar dos métodos para identificar la disminución de la proteostasis en las células musculares: obtener imágenes de la formación de agregados de proteínas durante el envejecimiento (1.1) y medir la proteotoxicidad que estos agregados causan con la edad hasta el inicio de la parálisis (1.2).
- Imagen de la formación de agregados de poliglutamina en el músculo durante el envejecimiento
nota: La progresión dependiente de la edad de la agregación de proteínas en las células musculares se visualiza utilizando repeticiones de poliglutamina (polyQ) fusionadas con una proteína fluorescente amarilla (YFP). Este protocolo describe el uso de la cepa AM140 rmIs132[unc-54p::Q35::YFP], pero también se pueden usar otras cepas variantes de poliglutamina. El transgén polyQ::YFP se expresa en el músculo utilizando el promotor específico del músculo unc-54. Los animales que expresan unc-54p::p olyQ::YFP sincronizados se visualizan en los días 1, 2, 3 y 4 de la edad adulta. Para visualizar los agregados unc-54p::p olyQ::YFP, utilice un microscopio compuesto equipado para fluorescencia o un microscopio de disección fluorescente. AM140 está disponible en el Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) en: https://cgc.umn.edu/strain/AM140
- En los días de toma de imágenes (día 1, 2, 3 y 4 de la edad adulta), elija 20 animales y móntelos en una configuración de portaobjetos de microscopio con una almohadilla de agarosa al 3% y una gota de 5 μL de azida sódica de 10 mM (diluida en tampón M9).
- Después de inmovilizar a todos los animales con azida de sodio (~ 5 minutos), obtenga imágenes de todo el cuerpo de los animales con una lente de aumento de 10x (Figura 1A). Para la obtención de imágenes, use un filtro FITC y la misma exposición para todos los animales. Deseche los portaobjetos después de la imagen.
nota: Alternativamente, los focos de YFP también se pueden cuantificar directamente en las placas, pero el movimiento debe inhibirse aplicando una corriente de dióxido de carbono sobre la placa mientras se marca. Este método alternativo es el más apropiado cuando se examina un gran número de afecciones.
- Después de la adquisición de imágenes, cuente el número de focos en los músculos de la pared corporal de todo el animal. Los focos son señales puntuadas más brillantes que se pueden diferenciar de la señal soluble más tenue en el fondo.
- Trazar la progresión de la acumulación de focos de YFP desde los días 1, 2, 3 y 4. Traza un gráfico XY donde X representa los días de la edad adulta e Y representa el número de focos unc-54p::p olyQ::YFP (Figura 1B). El número de focos en la condición experimental (por ejemplo, regulación a la baja o sobreexpresión de genes) se compara con los animales de control. Realizar análisis estadísticos entre los grupos en cada punto de tiempo observado para cada ensayo.
- Al comparar los recuentos de focos para solo dos condiciones, realice una prueba t de muestra independiente en cada punto de tiempo.
- Al comparar los recuentos de focos para más de dos condiciones, realice un análisis ómnibus de ANOVA unidireccional para cada punto de tiempo, incluidos los datos de todas las condiciones en ese punto de tiempo. Si el ANOVA ómnibus arroja un valor p significativo (es decir, p < 0,005), realice un análisis post-hoc con pruebas t de muestras independientes por pares para determinar las condiciones específicas entre las cuales se detectó una diferencia significativa en los focos (por ejemplo, para los grupos A, B y C, compare A & B, A & C y B & C).
2. Medición de las tasas de parálisis animal como sustituto de la toxicidad de la poliglutamina en las células musculares
NOTA: El aumento de los agregados de polyQ en el músculo dependiente de la edad provoca la disminución de la función muscular que impulsa la locomoción. Este defecto en la locomoción se puede determinar midiendo la tasa progresiva de parálisis en animales que expresan polyQ. Para el ensayo de parálisis, se puntúan los animales que expresan unc-54p::p olyQ::YFP sincronizados a los días 3, 5, 7 y 9 de la edad adulta. Agregue puntos de tiempo adicionales según sea necesario, para ampliar el rango de puntuación de modo que se pueda evaluar el efecto de la perturbación genética.
- En los días de puntuación (día 3, 5, 7 y 9 de la edad adulta), observe las placas de 6 cm que contienen 50 animales y anote el número de animales paralizados. Retire los animales paralizados del plato. Si los animales se han arrastrado fuera del plato o han muerto, deben ser censurados; Registre el evento para que pueda ser contabilizado en el análisis.
nota: Se considera que un animal está paralizado cuando no se observa ningún movimiento después de exponerlo a estímulos táctiles ligeros o suaves. La actividad de bombeo faríngeo se utiliza para determinar si los animales inmóviles están vivos o muertos.
- Al finalizar el experimento, calcule la tasa de parálisis para cada condición. Haga esto en cada punto de tiempo dividiendo la fracción de animales paralizados por el número total de animales observados para esa condición. Si observa varias placas por condición por punto de tiempo (es decir, placas replicadas), calcule la relación por separado para cada réplica.
- Represente la progresión de la tasa de parálisis en un gráfico XY (diagrama de dispersión). X representa los días de la edad adulta e Y representa las tasas de parálisis. Se compara la tasa de parálisis de los animales unc-54p::p olyQ::YFP con la de los animales control (Figura 1C). Realizar análisis estadísticos entre los grupos; En el caso de los ensayos múltiples, trate los ensayos de forma independiente. Utilice la Regresión de Riesgos Proporcionales de Cox y la prueba de Wald. La mayoría de las herramientas de análisis de datos que admiten el análisis de supervivencia también admiten el modelado de Cox.
- Transformar los datos: cada condición debe tener dos columnas, una para el tiempo y otra para el "evento". En cada punto de tiempo observado, agregue una fila con "0" para cada animal paralizado y un "1" para cada animal censurado. El número total de filas debe ser igual al número de animales iniciales en el plato para esa condición.
- Realice el modelado de riesgos proporcionales de Cox, seguido de la prueba de Wald, de acuerdo con las instrucciones del software estadístico. Un modelo univariado será apropiado para diseños de experimentos típicos. Para más de dos condiciones, si una prueba con todas las condiciones incluidas indica un resultado significativo (es decir, p < 0.005), se pueden realizar pruebas por pares entre condiciones para determinar los pares significativos específicos de condiciones.
nota: El modelo de Cox se basa en la suposición de que las condiciones de prueba modulan la probabilidad de un evento proporcionalmente a lo largo del tiempo. Esto significa, por ejemplo, que el modelo de Cox no sería apropiado para comparar una condición en la que la mayoría de los animales están paralizados en el día 1 con una condición en la que la mayoría de los animales están paralizados en el día 9. Extensiones del modelo de Cox, y otros enfoques para comparar proporciones paralizadas en cada punto de tiempo, están disponibles para los casos en que la suposición de riesgos proporcionales no se sostiene.
