Ensayo de co-incubación bacteriana: una técnica basada en microscopía de fluorescencia para visualizar la competencia bacteriana intraespecífica a nivel de una sola célula

Resumen

Fuente: Smith, S., et al., Cuantificación de la competencia interbacteriana mediante imágenes de fluorescencia de una sola célula. J. Vis. Exp. (2021).

Este video muestra un método basado en microscopía de fluorescencia para estudiar la competencia bacteriana a nivel de una sola célula. Este método proporciona información sobre la estructura y función de las comunidades bacterianas.

Protocolo

1. Coincubar cepas bacterianas

1. Elija dos cepas bacterianas para los ensayos de competencia bacteriana unicelular. En este caso, se utilizan dos cepas de V. fischeri: una cepa diana (ES11424) y una cepa inhibidora (MJ1125) que se sabe que mata la cepa diana utilizando el sistema de secreción de tipo VI en el cromosoma II (T6SS2)1, que es un mecanismo de matanza dependiente del contacto.
2. Transforme cepas con plásmidos estables que codifican genes para diferentes proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP o RFP) para distinguir visualmente los tipos de cepas en el microscopio. Aquí, la cepa inhibidora se marca con un plásmido que codifica GFP (pVSV102) y la cepa objetivo se marca con un plásmido que codifica dsRed (pVSV208).
3. Comience con cultivos de registro medio para ambas cepas, mida y registre la densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) para todas las muestras.
4. Normalizar cada muestra a un DO₆₀₀ = 1,0, lo que corresponde aproximadamente a 10⁹ UFC/mL para V. fischeri, diluyendo el cultivo con medio LBS.
5. Mezcle las dos cepas competidoras en una proporción de 1:1 en función del volumen añadiendo 30 μL de cada cepa normalizada a un tubo de 1,5 mL marcado. Vértice el cultivo de cepas mixtas durante 1-2 s.
   nota: En algunos casos, puede ser apropiado mezclar cocultivos en diferentes proporciones. Por ejemplo, cuando una cepa crece mucho más rápido que la otra, puede ser necesario iniciar la cepa de crecimiento más lento con una ventaja numérica para observar a la competencia. También puede ser necesaria la optimización si el OD₆₀₀ no corresponde a UFC/ml similares para ambas cepas.
6. Repita el paso 1.5 para cada réplica biológica y tratamiento. En el ejemplo que se muestra aquí, esto dará como resultado un total de cuatro tubos de deformación mixta: dos réplicas biológicas con la cepa inhibidora de tipo salvaje mezclada con la cepa objetivo y dos réplicas biológicas con la cepa mutante del sistema de secreción de tipo VI mezclada con la cepa objetivo.
7. Para asegurarse de que las células competidoras sean lo suficientemente densas para la muerte dependiente del contacto en la coincubación en la almohadilla de agar, concentre cada cultivo mezclado 3 veces centrifugando el cultivo mezclado en un tubo de centrífuga estándar de 1,5 mL durante 1 min a 21.130 x g, desechando el sobrenadante y resuspendiendo cada pellet en un medio de 20 μL lbs. Repita para cada muestra.
   nota: Algunas células bacterianas son sensibles al daño por centrifugación a alta rcf; En tales casos, el cultivo mezclado se puede centrifugar durante 3 min a 4600 x g. Además, al cuantificar la competencia dependiente del contacto, es importante asegurarse de que haya suficiente densidad celular en el portaobjetos para observar la matanza. En este artículo, los tratamientos "abarrotados", donde se observa la muerte, tuvieron aproximadamente 10 células/20 μm².

2. Configuración de la diapositiva

1. Cuando utilice un microscopio vertical, coloque una almohadilla de agarosa de ~5 mm² en un portaobjetos de vidrio estándar de 1 mm. Coloque 2 μL de un cultivo mezclado en la almohadilla de agarosa y coloque un cubreobjetos #1.5 (25 mm²) sobre la mancha. Véase la figura 1B.
2. Cuando utilice un microscopio invertido, coloque 2 μL de un cultivo mixto en el fondo del cubreobjetos #1.5 de una placa de Petri de 35 mm y coloque una almohadilla de agarosa de ~5 mm² sobre el punto de coincubación. Coloque un cubreobjetos de vidrio circular de 12 mm sobre la almohadilla de agarosa. Consulte la Figura 1C para ver un ejemplo.
3. Repita los pasos 2.1 o 2.2, dependiendo de la configuración del microscopio utilizada, para los tres cultivos mezclados restantes, lo que dará como resultado cuatro portaobjetos o placas para obtener imágenes.
4. Deje que las diapositivas se asienten en la mesa de trabajo durante aproximadamente 5 minutos antes de continuar. Esto permite que las células se asienten en la almohadilla de agar y eliminen el movimiento durante el proceso de obtención de imágenes.

3. Microscopía de fluorescencia

1. Comience enfocándose en las células con luz blanca (contraste de fase o CID) para minimizar los efectos del fotoblanqueo. Según el tamaño promedio de una sola célula bacteriana, use un objetivo de aceite de 60x o 100x.
2. Ajuste el tiempo de exposición y la configuración de adquisición para cada canal de modo que las celdas sean visibles en el canal apropiado con una detección mínima de fondo.
   nota: Es conveniente utilizar diferentes tiempos de exposición para diferentes canales, pero debe utilizarse el mismo tiempo de exposición en todas las réplicas biológicas y tratamientos para un canal determinado.
3. Para cada muestra, seleccione al menos cinco campos de visión (FOV) y adquiera imágenes en cada canal apropiado utilizando la configuración de adquisición (consulte los ejemplos en la Figura 2). Guarde los puntos XY de cada campo de visión para que se pueda obtener una imagen del mismo campo de visión durante el punto de tiempo final. Es necesario obtener imágenes del mismo campo de visión en cada punto de tiempo para determinar la proporción de área ocupada por las células diana o inhibidoras durante los pasos de análisis.
   nota: En este ejemplo, la fluorescencia de GFP se detecta utilizando un filtro con una longitud de onda de excitación de 467 a 498 nm y un filtro de emisión de 513 a 556 nm y es de color verde falso. La fluorescencia de dsRed se detecta utilizando un filtro con una longitud de onda de excitación de 542 - 582 nm y un filtro de emisión de 603 - 678 nm y es de color magenta falso.
4. Después de 2 h, repita el paso anterior para cada muestra utilizando los puntos XY guardados anteriormente (Figura 2).
   nota: Es posible que sea necesario optimizar el tiempo de las imágenes posteriores para organismos con diferentes tasas de crecimiento o mecanismos competitivos.

Resultados

Figura 1: Preparación de la almohadilla de agarosa y configuración de portaobjetos para ensayos de coincubación. (A) Configuración para hacer almohadillas de agarosa al 2%. Cinco capas de cinta de laboratorio (verde) se envuelven alrededor de un cubreobjetos en dos puntos separados por aproximadamente 20 mm. A continuación, se pipetea agarosa tibia al 2% en solución salina marina tam...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL	pescador	05-408-129
Pipeta monocanal de 10 uL
Pipeta monocanal de 1000 uL
Pipeta monocanal de 20 uL
Pipeta monocanal de 200 uL
agarosa	pescador	BP165-25	Agarosa de bajo punto de fusión
Plato Cellvis 35 mm	pescador	NC0409658	#1.5 Fondo de vidrio de cubierta
cloranfenicol	sigma	C0378	caldo (20 mg/mL en etanol); concentración final en medio (2 μg/mL LBS)
Software de análisis de imágenes FIJI	ImagenJ	https://imagej.net/Fiji/Downloads	Software de código abierto
Cubreobjetos Fisherbrand: Círculos	pescador	12-545-81P	#1.5 Cubreobjetos; 12 mm de diámetro
Sulfato de kanamicina	pescador	BP906-5	caldo (100 mg/mL en agua, esterilizante por filtro); concentración final en medio (1 μg/mL LBS)
Papel de seda para limpieza de lentes	pescador	S24530
Placas de Petri	pescador	FB0875713	estéril con tapa
Afeitar	pescador	S65921
Cubetas semi-micro	VWR	97000-586
espectrofotómetro
Portaobjetos de microscopio lisos Thermo Scientific Gold Seal	pescador	12-518-100B
Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cubierta de vidrio	pescador	22-050-235	#1.5 Cubreobjetos, 25 mm2
Aceite de inmersión tipo F	pescador	NC0297589
Microscopio de fluorescencia vertical o invertida con cámara y software de imagen			Las imágenes de este artículo se adquirieron en un microscopio fluorescente invertido Nikon TI-2 equipado con una cámara CMOS digital ORCA-Fusion utilizando el software NIS-Elements.
vórtice
Baño de agua			Se utiliza para mantener la agarosa caliente antes del pipeteo
Medios LBS
Tampón Tris 1M (pH ~7.5)			50 mL de tampón de 1 M (62 mL de HCl, 938 mL de agua desionizada, 121 g de Trizma Base)
Agar Técnico	pescador	DF0812-17-9	15 g (Añadir solo para platos)
Agua desionizada			950 mL
cloruro de sodio	pescador	S640-3	20 g
Triptona	pescador	BP97265	10 g
Extracto de levadura	pescador	BP9727-2	5 g
mPBS (PBS marino)			Solución salina tamponada con fosfato con sales marinas añadidas; utilizada para hacer almohadilla de agarosa
10 veces PBS	pescador	ICN1960454
Sal marina oceánica instantánea	Océano instantáneo	SS1-160P	Ajuste la concentración a la salinidad adecuada; aquí se utilizan 20 psu
Unidades de filtro de vacío estériles	pescador	SCGVU01RE	Se utiliza para filtrar-esterilizar mPBS
Bomba de vacío			Se utiliza para filtrar-esterilizar mPBS