Ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado: un ensayo de proximidad basado en perlas para cribar moléculas pequeñas que inhiben las interacciones proteína-proteína

Resumen

Fuente: Wang, L. et al., Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, demostramos el ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado, un ensayo de proximidad basado en perlas. Utiliza perlas aceptoras y donantes de tamaño homogéneo, inmovilizadas con dos proteínas que tienden a interactuar para detectar posibles moléculas pequeñas que inhiben las interacciones proteicas.

Protocolo

NOTA: En la Figura 1 se muestra una descripción general de este protocolo.

1. Expresión y purificación de GST-FKBP51 y GST-FKBP52 (Figura 1A)

1. Plásmidos
   NOTA: Obtenga clones de ADNc para FKBP51 humano (ID de clon: 5723416) y para FKBP52 humano (ID de clon: 7474554) del consorcio IMAGE.
   1. Amplificar el ADN humano FKBP51 por PCR con cebadores (adelante; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCTCTC-3') que contiene salientes de BamHI y XhoI y clonar en el vector pGEX6-1 en los sitios de restricción de BamHI / XhoI.
   2. Amplifique el ADN humano FKBP52 por PCR con cebadores (adelante; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', reverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCTCCAC-3') que contiene salientes de EcoRI y XhoI y clone en el vector pGEX6-2 en los sitios de restricción de EcoRI / XhoI.
      nota: La configuración y las condiciones de la reacción de PCR se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2.
   3. Verifique la secuencia insertada y transforme los plásmidos en la E. coli químicamente competente de acuerdo con el protocolo de fabricación.
2. Expresión y purificación de proteínas
   1. Añadir 25 g de base de caldo Luria (LB) en 1 L de agua destilada para hacer la solución de LB. Esterilizarlo en autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de enfriar, agregue 50 μg/mL de ampicilina.
   2. Tome una colonia de bacterias que expresen GST-FKBP51 o GST-FKBP52 y mézclela con 500 μL de solución de LB en un tubo de 1,5 mL. Vórtice.
   3. Añadir la mezcla de "1.2.2" en 1 L de solución LB en el matraz Erlenmeyer cubierto con papel de aluminio. Incubar el matraz Erlenmeyer en el agitador durante la noche a 37 °C.
   4. Inducir la expresión de proteínas añadiendo 1 mM de isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) al matraz Erlenmeyer y continuar la incubación durante 2 h más.
   5. Para obtener gránulos de celda, centrifugar a 5.000 x g durante 15 min. Retire el sobrenadante.
      nota: Los pellets de celda se pueden almacenar a -20 °C.
   6. Vuelva a suspender los gránulos de celda en 40 mL de PBS y sonique 3 x 20 s en hielo. Añadir 1 mM de PMSF, 1 mM de EDTA y un cóctel de inhibidores de la proteasa (1 comprimido) para prevenir la proteólisis.
   7. Centrifugar la suspensión durante 30 min 50.000 x g para eliminar los restos de células y aplicar el sobrenadante en una columna de trampa GST de 5 mL.
   8. Después de lavar la columna con 30 mL de PBS, eluir GST-FKBP51 y GST-FKBP52 con 5 mL de 10 mM de glutatión en PBS.
   9. Concentrado de proteínas en unidad de centrifugación de 15 mL 10.000 MWCO. Para eliminar el glutatión libre, pase los concentrados a través de la columna PD-10 equilibrada con PBS 0.5x y nuevamente concéntrese en el dispositivo de centrífuga de filtro.
   10. Recoja las fracciones que contienen proteínas. Verifique las proteínas en SDS-PAGE y ajuste las concentraciones de proteínas a 1 mg/mL.
       nota: El rendimiento típico de proteína es de 2-5 mg/L de cultivo. La proteína puede almacenarse a -20 °C.

2. Acoplamiento del péptido Hsp90 C-terminal a las perlas aceptoras (Figura 1B)

1. Preparación del péptido Hsp90
   1. Sintetizar diez péptidos de aminoácidos NH 2-EDASRMEEVD-COOH correspondientes a los aminoácidos 714-724 de la isoforma Hsp90 beta humana (UniProt ID: P08238) mediante un servicio de síntesis de péptidos.
   2. Diluir el péptido Hsp90 en PBS a una concentración de 1 mg/mL.
2. Preparación de las cuentas del aceptor
   1. Diluya las perlas aceptoras no conjugadas en PBS a una concentración de 1 mg/mL y transfiéralas a un tubo de 1,5 mL.
   2. Realizar el lavado por centrifugación a 16.000 x g durante 15 min. Retirar con cuidado el sobrenadante.
3. conjugación
   1. Establezca la relación entre las perlas y el péptido en 10:1. En el tubo de 1,5 mL que contiene 1 mg de gránulo aceptor (preparado como se describe anteriormente), agregue 1 mL de PBS (pH 7,4), 0,1 mg de péptido diluido, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL de una solución de 400 mM de cianoborohidruro de sodio (NaBH₃CN) en agua.
      cautela: El NaBH₃CN es tóxico; Use una capucha antihumos y guantes. La solución de NaBH₃CN debe estar recién preparada.
   2. Incubar durante 24 h a 37 °C con agitación de extremo a extremo (10-20 rpm) en un agitador rotativo.
4. Enfriamiento de reacción y lavado de perlas
   1. Añadir 20 μL de solución de Tris-HCl 1 M (pH 8,0) a la reacción para bloquear los sitios no reaccionados. Incubar durante 1 h a 37 °C.
   2. Centrifugar a 16.000 x g (o velocidad máxima) durante 15 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de perlas en 1 mL de solución de Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
   3. Repita el paso de lavado tres veces.
   4. Después de la última centrifugación, vuelva a suspender las perlas a 1 mg/mL en tampón de almacenamiento (1 mL de 0,5 × PBS con azida sódica al 0,01% como conservante). Almacene la solución de perlas aceptoras conjugadas a 4 °C protegida contra la luz.
      cautela: La azida de sodio es tóxica; Use una capucha antihumos y guantes.

3. El ensayo que sondea la interacción entre GST-FKBP51 o GST-FKBP52 y el péptido C-terminal Hsp90, y la inhibición con compuestos de masa molecular pequeña (Figura 1C)

1. Proteínas marcadas con GST que interactúan con perlas donantes de glutatión
   1. Configure las reacciones en placas de 384 pocillos.
   2. Prepare la solución que contiene 10 μg/mL de las perlas donantes de glutatión en 0,5x PBS, pH 7,4.
      nota: Después de un almacenamiento prolongado, las perlas se asientan y necesitan ser vertiginosas.
   3. Agregue GST-FKBP51 o GST-FKBP52 hasta una concentración final de 10 μg/mL.
   4. Incubar en la oscuridad a 25 °C durante 10 min.
      nota: En este paso, las proteínas marcadas con GST interactuarán con el glutatión unido a las perlas. Para cada pocillo se utilizarán 22,5 μL de esta mezcla. La concentración de los socios vinculantes debe determinarse empíricamente. Valore GST-FKBP51 y GST-FKBP52 y elija la concentración que dé la mejor señal.
2. Adición de compuestos
   1. Realizar diluciones en serie de compuestos de prueba en DMSO.
      nota: Las concentraciones utilizadas suelen ser de 10, 30, 100, 300, 1.000 y 3.000 μM.
   2. Agregue 0,25 μL de DMSO (control negativo) o péptido C-terminal Hsp90 (control positivo, 30 μM) o compuestos en DMSO a la esquina de cada pocillo de la placa. Utilice triplicados para cada concentración de compuesto.
   3. Añada 22,5 μL de la solución que contiene perlas donantes de glutatión con proteínas marcadas con GST a cada pocillo.
   4. Agite el plato suavemente con la mano pero a fondo. Incubar en la oscuridad a 25 °C durante 15 min.
      nota: Durante este tiempo, los compuestos interactuarán con el dominio TPR en el sitio de unión del péptido Hsp90 C-terminal.
3. Adición de cuentas aceptoras
   1. Diluir las perlas aceptoras con el péptido Hsp90 C-terminal adjunto a 100 μg/mL en 0,5x PBS.
   2. Agregue 2,25 μL de perlas aceptoras diluidas a cada pocillo.
   3. Mezcle suave pero bien. Incubar en la oscuridad a 25 °C durante 15 min.
      nota: En este paso, las perlas donante y aceptora se acercan mediante las interacciones proteína-péptido. El volumen final de la mezcla de reacción es de 25 μL. Por lo tanto, las concentraciones finales de los compuestos oscilan entre 0,1 y 30 μM.
4. Lectura de placas
   nota: Lea la placa utilizando un lector de placas configurado en el modo correspondiente.
   1. Encienda el instrumento y abra el software
   2. Elija el protocolo correspondiente.
   3. Haga clic en Editar mapa de placa y seleccione el pozo que se utiliza en la placa para la medición.
   4. Haga clic en Siguiente para continuar y Ejecutar el protocolo seleccionado.
   5. Después de la medición, haga clic en Mostrar resultados para ver los resultados.
   6. Exporte los datos.

Tabla 1: Configuración de la reacción de PCR para la amplificación de ADN FKBP51 y FKBP52 humano.

Componente de reacción	Volumen (μL)
Tampón PCR (5 x concentrado)	4
Imprimación directa	1
Imprimación inversa	1
plásmido	0.5
Mezcla dNTP (10 mM cada uno)	0.5
ADN polimerasa Phusion	0.5
Agua (grado de ADN)	12.5
total	20

Tabla 2: Condiciones del termocíclico para la amplificación del ADN humano FKBP51 y FKBP52.

etapa	Temperatura (°C)	Hora	Ciclos
Desnaturalización inicial	94	3 minutos	1
desnaturalización	94	30 segundos	35
recocido	56	30 segundos
extensión	72	1 minuto
Prórroga definitiva	72	5 minutos	1
Nota: La temperatura de la tapa es de 105 °C.

Resultados

Figura 1: Esquema de este protocolo. (A) Expresión y purificación de GST-FKBP51 y GST-FKBP52. (B) Acoplamiento del péptido Hsp90 C-terminal a las perlas aceptoras. (C) El ensayo que sondea la interacción entre GST-FKBP51 o GST-FKBP52 y el péptido C-terminal Hsp90. Inhibición con compuestos de pequeña masa molecular.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Placas de 384 pocillos	Perkin Elmer	6008350	Volumen del ensayo: 25 ml
Unidad de centrifugación Amicon 10.000 MWCO	Millipore	UFC901008	Proteína concentrada
ampicilina	sigma	A0166	antibióticos
Agitador de bacterias Unimax 1010	Heidolph		Cultivo de bacterias
Clones de ADNc para FKBP51 humano	Fuente: BioScience	ID de clon: 5723416	Vector pCMV-SPORT6
Clones de ADNc para FKBP52 humano	Fuente: BioScience	ID de clon: 7474554	Vector pCMV-SPORT6
E. coli químicamente competente	Invitrogen	C602003	Un disparo BL21 estrella (DE3)
Dmso	Supelco	1.02952.1000	Compuestos diluidos
DPBS	Gibco	14190-144	Preparar la solución
EDTA	Calbiochem	344504	Evitar la proteólisis durante la sonicación
glutatión	sigma	G-4251	Eluir proteínas marcadas con GST
Cuentas donantes de glutatión	Perkin Elmer	6765300	Cuenta donante
Columna de trampa GST	Cytiva (GE Healthcare)	17528201	Purificar proteínas marcadas con GST
Isopropil-β-D-tiogalactósido	Thermo Fisher Scientific	R0392	Inducir la expresión de proteínas
Caldo LB (Molinero)	sigma	L3522	Medio de crecimiento microbiano
Instrumento de PCR	BIO-RAD	Termociclador S1000	Amplificación/PCR
Columna PD-10	Cytiva (GE Healthcare)	17085101	Intercambio de soluciones
Vector pGEX-6P-1	Cytiva (GE Healthcare)	28954648	plásmido
Vector pGEX-6P-2	Cytiva (GE Healthcare)	28954650	plásmido
Lector de placas	Perkin Elmer	Lector multietiqueta EnSpire 2300	Leer la placa alfa
Software de lectura de placas	Perkin Elmer	Gerente de EnSpire	Software de lectura de placas
Protocolo de software del lector de placas	Perkin Elmer	Alfa de 384 pocillos Bajo volumen	Utilice este protocolo para leer la placa
PMSF	sigma	Página 7626	Evitar la proteólisis durante la sonicación
cóctel de inhibidores de proteasa	sigma	S8830	Evitar la proteólisis durante la sonicación
Azida de sodio	sigma	S2002	Como conservante
Cianoborohidruro de sodio (NaBH3CN)	sigma	156159	Activa la matriz para el acoplamiento
Diez aminoácidos péptido NH2-EDASRMEEVD-COOH correspondientes a los aminoácidos 714-724 de la isoforma humana Hsp90 beta	Péptido 2.0 inc		Sintetizar el péptido Hsp90 C-terminal
Rotador de tubo de ensayo	LABINCO		Hacer agitación de extremo a extremo
Tris-HCl	sigma	10708976001	Bloquear los sitios no reaccionados de las cuentas aceptoras
Preadolescente-20	sigma	Página 1379	Evite la agregación de perlas
Ultracentrífuga Avanti J-20 XP	Beckman Coulter		Centrífuga para obtener gránulos de células bacterianas
Disruptor celular ultrasónico	Microson		Sonicar células para liberar proteínas
Cuentas aceptoras no conjugadas	Perkin Elmer	6762003	Cuentas aceptoras
Módulo XCell SureLock Mini-Cell y XCell II Blot	Invitrogen	EI0002	SDS-PÁGINA