1. Siembra de las células Vero
- El día antes de iniciar el ensayo de placa, tripsinice las células de Vero y vuelva a suspenderlas en el medio regular Dulbecco's Modified Eagles (DMEM) y complemente según la metodología estándar de cultivo celular. Resuspender las células tripsinizadas en 10 mL de DMEM por matraz T-75 de las células Vero confluentes (~107 células).
NOTA: DMEM se utiliza para los ensayos de placa en lugar de alfa-MEM porque ralentiza ligeramente la tasa de crecimiento celular y favorece mejores resultados de los ensayos de placa.
- Cuente las células con el método preferido (por ejemplo, un hemocitómetro estándar con exclusión de azul de tripano).
- Siembre las células en 4 x 106 células/placa; para el VHS-2, use placas de 6 pocillos con 2.5 mL de DMEM (con suplementos) por pocillo; y para el VHS-1, use placas de 12 pocillos con 1.25 mL de DMEM (con suplementos) por pocillo.
NOTA: El número de células debe ser constante independientemente de la placa utilizada, aunque el tamaño de los pocillos es importante en lo que respecta a la precisión en el ensayo de la placa. Es esencial que las células se distribuyan uniformemente, lo que se puede lograr de manera más efectiva moviendo la placa hacia adelante y hacia atrás, no de manera circular.
- Deje que las células crezcan durante la noche a 37 °C/5% CO2 en una incubadora humidificada.
NOTA: La humedad se mantiene con una olla con agua destilada que contiene un alguicida en el fondo de la incubadora.
2. Dilución de la muestra
- Complete la dilución de la muestra y la adición del virus a las células en una sesión de laboratorio.
PRECAUCIÓN: Los VHS-1 y -2 son infecciosos para los seres humanos y deben manipularse bajo una contención de bioseguridad adecuada (BSL-2). Mantenga todos los materiales que entren en contacto con el virus separados y desinfecte con un agente cuaternario con una dilución de 1/256 (consulte la Tabla de materiales), yodóforo, lejía o detergente iónico fuerte (por ejemplo, SDS) antes de sacarlos del gabinete de bioseguridad.
- Al día siguiente de la siembra de las células Vero, diluya en serie cada muestra de virus para que se coloque en placa en 1x PBS; por lo general, use diluciones de 10 veces para el seguimiento más preciso.
- Realice estas diluciones a través de 10-4 (para concentraciones bajas de virus) o a través de 10-9 (para expectativas de muestras de títulos más altos) con al menos 1 mL de cada muestra restante para el ensayo de placa en sí.
- Mantenga todas las diluciones virales en hielo (no más de 1 h) hasta que esté listo para agregar estas muestras de virus diluidas a las células.
>3. Adición de virus a las células
- Retire el medio de cultivo celular de uno o dos pocillos con una pipeta.
NOTA: No utilice un aspirador porque elimina demasiado líquido de la monocapa celular y seca las células. Una consideración crucial es asegurarse de que la monocapa celular permanezca hidratada durante todo el curso del experimento. Si las células se secan, se lavarán de la placa en el paso final y generarán datos inutilizables. Por lo tanto, procese solo uno o dos pozos a la vez para reducir esta posibilidad.
- Agregue con cuidado la muestra de virus diluida (se utilizan 100-400 μL y 50-200 μL de muestra de virus para placas de 6 y 12 pocillos, respectivamente) gota a gota a cada monocapa, agregando las gotas por el costado de cada pocillo. Repita el proceso para cada uno o dos pocillos hasta que toda la placa esté llena con las muestras de virus que se están colocando.
NOTA: Agregar las gotas al centro del pocillo puede desprender inadvertidamente las células del sustrato.
- Agite suavemente toda la placa con la mano para asegurarse de que el PBS que contiene el virus cubra toda la monocapa de células en cada pocillo, luego coloque la placa en una incubadora de CO2 a 37 °C para permitir que el virus se adsorba.
- Cada 10 minutos dentro de 1 hora, retire la placa de la incubadora, vuelva a mecerla suavemente para propagar el virus de manera más uniforme por cada pocillo y luego vuelva a colocarla en la incubadora><.
NOTA: Cada experimento dictará el número de réplicas y qué diluciones se utilizan; La preferencia del lector dicta esa decisión.
- Para disminuir la posibilidad de contar inadvertidamente el inóculo no absorbido, retire la muestra de virus de los pocillos con puntas de pipeta de 1000 μL y colóquela en un vaso de precipitados><.
NOTA: Nuevamente, este procedimiento se lleva a cabo con solo uno o dos pocillos a la vez para mantener la hidratación de la monocapa celular.
- Coloque 2,5 mL de una capa de metilcelulosa (disuelva el 5% de metilcelulosa p/p en 100 mL de PBS, autoclave durante 15 min a 121 °C y 15 psi en un ciclo líquido, luego agregue 375 mL de DMEM más 25 mL de FBS).
- Una vez que toda la placa contenga la superposición, vuelva a colocar la placa en la incubadora para permitir el crecimiento durante dos días><.
NOTA: Si se permite que el virus y las células crezcan durante tres días, incluso en DMEM más suplementos, puede producirse una pérdida sustancial de células en la monocapa, comprometiendo así los datos finales.
- Desinfecte el vaso de precipitados, generalmente con la adición de lejía, un yodóforo o un virucida similar, antes de sacarlo del gabinete de bioseguridad.
4. Tinción para placas
- Después de la incubación de dos días, retire la capa de metilcelulosa con una pipeta, nuevamente uno o dos pocillos a la vez, y colóquela en un vaso de precipitados.
- Agregue ~ 2 mL de violeta cristalino al 1% (ver Tabla de Materiales) en etanol al 50% a cada pocillo para manchar las placas.
NOTA: No es esencial eliminar hasta la última gota de la superposición.
- Incubar la placa con todos los pocillos llenos de tinte durante 30 min a 37 °C. En este punto, desinfecte el vaso de precipitados como se indica en el paso 3.8.
- Lave los platos vigorosamente con agua del grifo hasta que la escorrentía esté clara.
NOTA: Un suave chorro de agua no es lo suficientemente vigoroso; Se requiere la presión total de un accesorio de fregadero de laboratorio.
- En este punto, asegúrese de que haya diferencias de aproximadamente 10 veces en el número de placas en cada serie de dilución.
- Deje que las placas se sequen durante la noche boca abajo, después de lo cual se pueden contar las placas individuales.
