Marcaje final de dUTP nick mediado por transferasa terminal: ensayo TUNEL: un método in situ para detectar la fragmentación del ADN en células apoptóticas

Resumen

Fuente: Brannelly, L. A., et al. Uso de ensayos de etiquetado de puntos de dUTP Nick mediado por transferasa terminal (TUNEL) y caspasa 3/7 para medir la muerte de células epidérmicas en ranas con quitridiomicosis. J. Vis. Exp. (2018).

En este vídeo, se realiza el ensayo TUNEL para detectar la presencia de células apoptóticas en una muestra. El estudio consiste en el uso de una ADN polimerasa especial, la desoxinucleotidil transferasa terminal, que cataliza la adición de dUTP marcadas al extremo 3' del ADN fragmentado, que puede observarse e identificarse bajo un microscopio de fluorescencia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Ensayo TUNEL.

1. Sacrificar a los animales que muestren signos clínicos de quitridiomicosis y a un número igual de animales de control Bd negativos.
2. Diseccionar muestras de piel (dorsal, ventral y muslo) de cada animal. Fije las muestras de piel durante 2 h en formaldehído tamponado con fosfato al 4% v/v. El tiempo de fijación corto y constante permite que los tejidos se fijen por completo, pero también permite una tinción inmunohistoquímica eficaz y precisa. Luego transfiera a etanol al 80% hasta incrustar para seccionar.
3. Incrustar la piel en cera de parafina para la preparación histológica siguiendo los métodos estándar. Brevemente, el protocolo es el siguiente:
   1. Deshidrate los tejidos en una serie graduada de etanol y limpie el etanol con xileno. Incruste el tejido en cera de parafina y coloque las tres muestras de piel de cada individuo en un bloque de parafina.
4. Cortar la piel con un micrótomo siguiendo la preparación histológica estándar. Divida el tejido en serie a 5 μm y luego fíjelo a portaobjetos de vidrio hidrófilo. Coloque cuatro histosecciones seriadas por tipo de piel por portaobjetos. Haga tres portaobjetos por individuo con secciones de piel en serie, recuerde que cada portaobjetos tiene cuatro secciones de cada tejido adheridas.
5. Tiñe los portaobjetos en el siguiente orden:
   1. Teñir el primer portaobjetos con hematoxilina seguido de una contratinción con eosina (H&E). Esta diapositiva es para visualizar la ubicación de los esporangios Bd dentro de la piel.
   2. Teñir el segundo portaobjetos después de un ensayo TUNEL disponible en el mercado para la preparación histológica y seguir las instrucciones del fabricante, que se describen a continuación.
      1. Primero, desparafinar las secciones de tejido en un frasco de coplin lavando los portaobjetos con tres cambios de xileno durante 5 minutos por lavado y luego con dos cambios de etanol al 100% durante 5 minutos cada lavado. Siga con un lavado de etanol al 95% durante 3 minutos y luego con etanol al 70% durante 3 minutos. Termina con un lavado de PBS durante 5 min.
      2. Trate previamente el tejido con una enzima digestora de proteínas recién diluida (proteinasa K a una concentración de 20 μg/mL diluida en PBS) y agréguela directamente al portaobjetos. Dejar incubar durante 15 min. Lavar con dos cambios de PBS en un frasco de coplin durante 2 minutos cada uno.
      3. Retire el exceso de líquido y enfríe con peróxido de hidrógeno al 3.0% en PBS en un frasco de coplin durante 2 minutos a temperatura ambiente. Enjuague dos veces con PBS, durante cinco minutos en cada lavado.
      4. Retirar el exceso de líquido y, a continuación, aplicar 75 μL/5^cm2 del tampón de equilibrio directamente sobre el tejido del portaobjetos. Incubar durante 10 s. Retirar el exceso de líquido alrededor de la sección y aplicar 55 μL/5^cm2 de enzima desoxinucleotidil transferasa (TdT) terminal en funcionamiento. Incubar en una cámara humidificada durante 1 h a 37 °C.
      5. Después de la incubación de TdT, coloque el portaobjetos en un frasco de coplin con tampón de parada / lavado de fuerza de trabajo, agite durante 15 s e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave el portaobjetos con tres cambios de PBS durante 1 minuto por lavado. Retira el exceso de líquido.
      6. Aplique el conjugado anti-digoxigenina (rodamina) que se ha calentado a temperatura ambiente en el tejido, 65 μL/5 cm². Incubar en una cámara humidificada durante 30 minutos a temperatura ambiente y evitar la exposición a la luz. Lavar con cuatro cambios de PBS durante 2 min por lavado. Retira el exceso de líquido.
      7. Termine añadiendo 15 μL de 0,5 - 1 μg/mL de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) en el medio de montaje del portaobjetos al portaobjetos, que actúa como contramancha. Luego cubra con un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas o cemento de caucho. Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad, ya que el ensayo es sensible a la luz.
   3. Teñir el tercer portaobjetos utilizando el ensayo TUNEL y la contratinción DAPI, pero utilizarlo como control positivo y negativo para cada muestra.
      NOTA: De las 4 histosecciones en los portaobjetos de control, las primeras 2 son réplicas de control positivo y las últimas 2 son réplicas de control negativo.
      1. Para los controles positivos, en lugar del paso 1.5.2.2, pretratar el tejido con tampón DN (30 mM de base de trizma, pH 7,2, 4 mM de MgCl₂, 0,1 mM de DDT) y dejar incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, disuelva la Dnase I en tampón DN para obtener una concentración final de 0,1 ug/mL, y aplíquelo directamente al portaobjetos. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lavar el portaobjetos con 5 lavados de dH₂O durante 3 minutos cada lavado. Seca el exceso de líquido. A continuación, reanude el ensayo TUNEL como se indica en la sección 1.5.2.3.
      2. En el caso de los testigos negativos, no añadir la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) a dichas muestras (tal como se describe en la sección 1.5.2.4).

2. Observe los deslizamientos de TUNEL inmediatamente después de completar el ensayo.

1. Tome fotos a intervalos aleatorios a lo largo de cada sección de la piel a 200X usando un microscopio fluorescente, usando filtros tanto para la tinción de rodamina, que revela las células apoptóticas y aparece roja, como para DAPI que revela todos los núcleos y aparece azul, de modo que se pueda generar una superposición de células. Asegúrese de que se fotografíen al menos 100 células por sección de piel por muestra. Guarde los portaobjetos en una caja de microscopio oscura a -20 °C.
2. Cuente las celdas (teñidas con DAPI azul) por imagen. Asegúrese de contar al menos 100 células por sección de piel. Para llegar a 100 celdas, cuente todas las celdas dentro de la imagen. Si hay menos de 100 células en una imagen, cuente otra imagen hasta que se alcancen al menos 100 células por sección de piel por animal.
3. A continuación, cuente el número de células TUNEL-positivas en las mismas imágenes (teñidas con rodamina roja). Las células TUNEL-positivas, que indican apoptosis y no necrosis o fondo, son células individuales con bordes celulares claros (las membranas están intactas sin lisis). A veces, las células se encogen para formar cuerpos apoptóticos.
4. Localice las áreas contadas en el ensayo TUNEL y analice las regiones correspondientes en las histosecciones teñidas con H&E. Confirmar que las secciones teñidas con H&E corresponden a los sitios de infección por Bd, lo que garantiza que los sitios infectados por Bd se utilicen al contar las células apoptóticas en el ensayo TUNEL.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
POLARstar Omega	BMG Labtech		Lector de placas luminiscentes
Placa inferior clara plana de 384 pocillos	Corning	3707
Placa de fondo plano blanco con brida baja de 384 pozos	Corning	3570
Formal-Fixx 10% Formalina Neutral Tamponada	pescador	6764254
Kit de detección de apoptosis in situ ApopTag Red	Merck Millipore	S7165
PBS (solución salina tamponada con fosfato), pH 7,2 (1X)	Termo/Vida	20-012-043
Parafilm	Bemis	PM996
Etanol, 200 Proof, Grado Molecular	pescador	BP2818500
Miscroscopio fluorescente ZEISS Axio Scan	Carl Zeiss		Microscopio fluorescente
Placas de Petri para cultivos celulares	Nunc	263991