Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Cría y Monitoreo de Animales
- Aloje a los animales individualmente, en un ambiente apropiado para la especie, con un horario adecuado de agua, alimentación y limpieza. Revise a los animales a diario.
- Utilice individuos adultos de la amenazada Litoria verreauxii alpina (para el ensayo Caspasa 3/7, Sección 4), donados de instalaciones de cría en cautividad. Mantenga a los animales a 15 - 18 °C, sobre un sustrato de musgo y grava, rocíelos diariamente con agua de ósmosis inversa y aliméntelos 3 veces por semana con grillos cargados de tripa.
- Recopile datos sobre cada individuo una vez a la semana. Frote un hisopo de los individuos para detectar Bd como se describe en el paso 2.1. Pese a cada animal hasta los 0,1 g con una báscula y mida la longitud del hocico hasta la ventilación (SVL) con una precisión de 0,01 mm con calibradores de cuadrante.
- Después de la inoculación (como se describe en la Sección 3), examinar diariamente a los animales para detectar signos clínicos de infección (descamación irregular de la piel, inapetencia, enrojecimiento de las patas, letargo o reflejo de enderezamiento tardío) de acuerdo con las directrices de ética animal. Aplicar la eutanasia a los animales si hay signos clínicos y morbilidad.
- Eutanasia con una sobredosis de metanosulfonato de tricaína (MS222) (0,1% p/v MS222 a pH 6 - 7 con bicarbonato de sodio en agua del grifo envejecida). Mantenga a los animales en MS222 durante 10 minutos después de que cese todo movimiento y no muestren respuesta a los estímulos.
2. Pruebas para la infección por Bd
- Hisopado para Bd
- Frote cada animal con un nuevo hisopo de rayón estéril (un hisopo por animal). Use el siguiente método de hisopado: cinco veces en el ventor y cinco veces en cada muslo, costado y extremidad. Esto es un total de 45 golpes.
- Gire suavemente el hisopo durante y entre los golpes para garantizar una captura efectiva del ADN. Rompa la punta del hisopo en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdelo a -20 °C hasta la extracción.
- Extracción de ADN y ensayo qPCR
- Extraiga el ADN genómico de los hisopos añadiendo 50 μL de un reactivo de extracción de ADN disponible en el mercado con 30 - 40 mg de perlas de sílice de 0,5 mm. Batido de cuentas las muestras en un disruptor de células batidor de cuentas a velocidad máxima durante 2 min. Después del paso del batidor de perlas, centrifugar las muestras a 2.000 x g durante 1 min.
- Incubar las muestras a 100 °C durante 10 min y dejar que se enfríen. Centrifugar las muestras a 5.000 x g durante 3 minutos y, a continuación, transferir el sobrenadante a tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 ml y almacenar a -20 °C hasta la qPCR.
- Utilice la PCR cuantitativa (qPCR) siguiendo a Boyle et al. 2004 para analizar la carga de infección. Utilice las siguientes modificaciones:
- Muestras de extracción de ADN diluido 6:100 con agua desionizada doble. Agregue 0,7 μL de albúmina sérica bovina (BSA) a cada pocillo para ayudar a prevenir la inhibición de la PCR. Ejecute cada muestra en singlicado. En cada placa, use un control negativo (sin plantilla) y un control positivo con una serie de patrones de dilución para estimar la carga de zoosporas (infección).
3. Inoculación
- Cultura Bd
- Prepare el caldo de cultivo añadiendo 16 g de triptona, 2 g de hidrolizado de gelatina y 4 g de lactosa (TGHL) a 1 L de agua desionizada. Esterilizar en autoclave (121 °C durante 40 min) y dejar enfriar el caldo.
- Inocular el aislado de Bd (en este caso, aislado del aislado de Nueva Gales del Sur, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, pasaje número 11) en un caldo TGHL y cultivar durante 7 días a 23 °C, luego transferir el cultivo del caldo a placas de agar TGHL.
- Para hacer los platos, agregue 16 g de triptona, 2 g de hidrolizado de gelatina, 4 g de lactosa (TGHL) y 10 g de agar bacteriológico a 1 L de agua desionizada y autoclave (121 °C durante 40 min). Una vez que la mezcla esté lo suficientemente fría como para tocarla, pero antes de que se solidifique, vierta el agar TGHL en placas de cultivo de 92 mm de diámetro para que estén llenas de 1/4 a 1/3, en una cabina de seguridad biológica de Clase II.
- Cuando el agar se haya solidificado y enfriado por completo, inocule cada placa con 0,5 mL de Bd del caldo líquido y extienda uniformemente. Deje que la mezcla de caldo Bd se seque en un plato durante aproximadamente 1 h y luego selle las placas con una película plástica de parafina. Incubar las placas con el agar hacia abajo a 23 °C durante 5 - 7 d.
- Placas de inundación para solución de inoculación de zoosporas
- Compruebe la motilidad de las zoosporas bajo un microscopio óptico invertido para garantizar la viabilidad diariamente antes de la inoculación. Cuando la liberación de zoosporas es alta, con muchas zoosporas nadando fuera de los esporangios, el cultivo está listo para la inoculación.
- Inundar cada placa con 3 ml de agua del grifo envejecida o agua de estanque artificial, vertiendo el agua en la placa e incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que las zoosporas se liberen en el agua. Después del período de incubación, decantar la suspensión de zoosporas en un nuevo recipiente estéril.
- Calcule la concentración de zoosporas siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando un hemocitómetro. Una vez conocida la concentración de la suspensión de zoosporas, diluir la suspensión hasta una concentración de 1 x 106 zoosporas por 3 mL con agua del grifo envejecida.
- Inocular animales
- Inocular a cada animal vertiendo 3 mL de mezcla de inóculo sobre su ventriz en recipientes individuales de 50 mL. Deje que el exceso de inóculo se acumule en la base del recipiente de inoculación. Deje a cada animal en un recipiente de inoculación individual durante 24 horas para asegurar la infección, y después de la inoculación de 24 horas, devuelva cada individuo a un terrario desinfectado.
- Desinfecte los terrarios con una solución de lejía comercial al 13% de volumen/volumen (v/v), enjuague al menos dos veces con agua y luego deje secar durante no menos de 24 horas.
- Para los controles con Bd negativo, se debe inocular a los animales utilizando los mismos métodos que en 3.2 - 3.3, pero inundando las placas de agar sin Bd con 5 mL de agua del grifo envejecida en lugar de placas de agar inoculadas con Bd.
4. Ensayo de caspasa 3/7
- Recoja las puntas de los dedos de los pies de cada animal (tanto expuestas a Bd como negativas a Bd) una vez por semana hasta la semana 3 después de la inoculación, y quincenalmente hasta el final del experimento, hasta 8 dedos por individuo.
- Cortar la punta de la punta del pie en la segunda falange con unas tijeras esterilizadas por llama, colocarla en un microtubo de 1,5 mL y congelar inmediatamente a -80 °C.
- Extraiga proteínas de una muestra de dedo del pie congelada.
- Coloque las muestras en 100 μL de tampón de muestra (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) con dos perlas de acero inoxidable (3,2 mm) en un microtubo con tapón de rosca de 1,5 mL. Lise las muestras en 4 ciclos de 1 min batiendo las perlas a la máxima velocidad (en el mismo batidor de perlas que se utilizó en el paso 1.2.1) seguido de 3 min en hielo. Después de la lisis, centrifugar las muestras a 12.000 x g y 4 °C durante 5 min. Recoja el sobrenadante para usarlo en el ensayo.
- Cuantificar la concentración de proteínas por muestra mediante el ensayo de Bradford.
- En una placa de 384 pocillos, mezcle 10 μL de extracto de proteína con 10 μL de reactivo Bradford e incube durante 2 minutos a temperatura ambiente. Realice cada muestra por duplicado, junto con una serie de estándares de dilución BSA de 5 veces. Lea la absorbancia a 595 nm en un lector de placas de absorbancia.
- Alternativamente, si las muestras de la punta del pie son demasiado pequeñas (la concentración de proteína está cerca del estándar más bajo según lo determinado por el ensayo de Bradford o si las ranas que se muestrean tienen menos de 3 g de peso total), estandarice las muestras estimando el área de la superficie de la piel utilizando fotografías, en lugar del ensayo de Bradford.
- Antes de extraer las proteínas de la muestra para el ensayo de caspasas, fotografíe cada dedo del pie con un aumento de 40X utilizando un microscopio de luz invertida.
- Analice la muestra del dedo del pie utilizando un software de imágenes por computadora, estimando el área del dedo del pie. Para ello, dibuja una línea alrededor del borde de la pinza del dedo del pie y haz que el software de imágenes estime el área dentro de la forma. Luego multiplique esa área por pi (3.14), lo que aproximará el área de la superficie de la muestra de piel tridimensional (ya que la longitud x el área de la sección transversal (pi x diámetro) da el área de la superficie exterior de un tubo).
- Realice el ensayo de caspasa 3/7.
- En una placa de luminiscencia de 384 pocillos, agregue 10 μL de reactivo de caspasa 3/7 disponible en el mercado y 10 μL de extracto de proteína. Ejecute cada muestra por triplicado.
- Mezcle los reactivos agitando la placa lentamente durante 15 s. Incube la placa lejos de la luz durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mida la luminiscencia con un lector de placas luminiscentes.
