El ensayo de fagocitosis: una técnica de inmunotinción para visualizar el envolvimiento de células apoptóticas en las células embrionarias de Drosophila melanogaster

Resumen

Fuente: Nonaka, S. et al. Ensayo de fagocitosis para células apoptóticas en embriones de Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).

Este video muestra una técnica de inmunotinción para visualizar la absorción de células apoptóticas en las células embrionarias homogeneizadas de Drosophila melanogaster. Este método proporciona información sobre la fisiología celular mediante la determinación del grado de envolvimiento de las células apoptóticas.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Tinción de hemocitos

1. Inmunotinción con un anticuerpo anti-Croquemort
   1. Remoje en serie los portaobjetos de vidrio en metanol durante 10 minutos, en PBS que contenga Triton X-100 al 0,2 % (v/v) durante 10 minutos y luego en PBS durante 10 minutos.
   2. Monte 20 μL de suero porcino entero al 5% (v/v) en PBS que contenga 0,2% (v/v) de Triton X-100 en las células para bloquear. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 20 min.
   3. Retire la solución de los portaobjetos de vidrio y monte 20 μL de antisuero anti-Croquemort (0,1% (v/v)) en PBS que contenga 0,2% (v/v) Triton X-100 en las células. Incubar los portaobjetos a 4 °C durante la noche.
   4. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS que contenga 0.2% (v/v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 veces.
   5. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 10 min.
   6. Monte 20 μL de IgG anti-ratas marcada con fosfatasa alcalina (0,5% (v/v)) en PBS que contenga 0,2% (v/v) de Triton X-100 y 5% (v/v) de suero porcino entero en células a temperatura ambiente durante 1 h.
   7. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS que contenga 0.2% (v/v) de Triton X-100 durante 10 minutos 5 veces.
   8. Remoje los portaobjetos de vidrio en un tampón que contenga 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl y 50 mM de MgCl2 durante 10 min.
   9. Monte la solución de sustrato de fosfatasa que contiene 0,23 mg/mL de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), 0,35 mg/mL de tetrazolio azul nitro (NBT), 100 mM de Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM de NaCl y 50 mM de MgCl₂ en las células.
   10. Observe las células bajo un microscopio para ver si la tinción es adecuada. Cuando aparezcan señales púrpuras fuertes en los gránulos de los hemocitos, retire la solución de sustrato y remoje los portaobjetos de vidrio en un tampón que consta de 10 mM de Tris-HCl, pH 8.5 y 1 mM de EDTA. Se recomienda teñir durante aproximadamente 5 a 10 minutos.

2. Tinción de células apoptóticas por TUNEL

1. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 5 min.
2. Repita con el nuevo PBS.
3. Monte el tampón de equilibrio (consulte la tabla de materiales) en las celdas durante 10 minutos.
4. Retire la solución de los portaobjetos de vidrio y monte 20 μL de solución de TdT que contenga 5 μL de desoxinucleotidil transferasa terminal y 15 μL de tampón de reacción en las células a 37 °C durante 1 h.
5. Retire la solución de los portaobjetos de vidrio y sumérjalos en un tampón que consta de 0,5 mL de tampón STOP/Wash y 17 mL de agua.
6. Remoje los portaobjetos en PBS durante 5 minutos 3 veces.
7. Monte 20 μL de anti-digoxigenina-peroxidasa en las células a temperatura ambiente durante 30 min.
8. Remoje los portaobjetos de vidrio en PBS durante 5 minutos 4 veces.
9. Remoje los portaobjetos de vidrio en una solución de sustrato de peroxidasa que consta de 30 mL de Tris-HCl de 50 mM, pH 7,5 que contiene una microespátula completa de tetratricloricloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) y 0,002% (v/v) H₂O₂ durante 30 s.
10. Repita el paso anterior hasta que las células apoptóticas se tiñan de marrón. Remoje los portaobjetos de vidrio en agua para detener la reacción de la peroxidasa.
11. Encierre las celdas con agua para la observación.

3. Medir el nivel de fagocitosis de las células apoptóticas

1. Observar las muestras bajo un microscopio óptico para evaluar el nivel de fagocitosis. Cuente las células positivas para Croquemort o las células positivas para GFP como hemocitos, las células positivas para TUNEL como células apoptóticas y las células dobles positivas como hemocitos fagocitadores.
2. El índice fagocítico se define como el número de células dobles positivas con respecto al número total de células positivas para Croquemort o células positivas para GFP. Se recomienda observar más de 300 hemocitos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Suero de cerdo entero	MP Biomedicals	55993	Para el bloqueo
Kpl Anti-Rata IgG (H+L) Ab MSA, AP	KPL	475-1612	anticuerpo secundario para teñir hemocitos con un anticuerpo anti-Croquemort
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato	Roche	11383221001	BCIP, para la tinción de hemocitos
Tetrazolio azul nitro	Roche	11383213001	NBT, para la tinción de hemocitos
Anticuerpo anti-Croquemort			descrito anteriormente en Manaka et al, J. Biol. Chem., 279, 48466-48476
Kit de detección de apoptosis in situ con peroxidasa apop	Millipore	S7100	Para la tinción de células apoptoíticas. Este kit incluye tampón de equilibrio, tampón de reacción, tampón STOP/Wash, enzima TdT y anti-digoxigenina-peroxidasa.
Tetratricloruro de 3,3'-diaminobenzidina	Nacalai Tesque	11009-41	DAB, para la tinción de células apoptoíticas

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