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Todos los procedimientos que involucran participantes humanos se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano y han sido revisados por la junta de revisión institucional local.
1. Cultivo y preparación de la línea celular de monocitos THP-1
- Cultivo de monocitos THP-1 como cultivo en suspensión en matraces T25 a 37 °C + 5% CO2. Las células deben cultivarse en 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% de suero fetal bovino (FBS).
- Cada día, suspenda las células de manera uniforme en todo el medio de crecimiento agitando suavemente el matraz, luego cuente inmediatamente las células con un hemocitómetro. Las células deben pasar una vez que la densidad celular alcance 1 x 106 células/mL:
- Precalentamiento RPMI 1640 + 10% FBS en un baño de agua a 37 °C.
- Transfiera 2 x 105 celdas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL o un tubo cónico de 15 mL, y granule las celdas centrifugando a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min.
- Retire el sobrenadante sin alterar el pellet de la célula y vuelva a suspender el pellet en 1 mL (tubo de microcentrífuga de 1,5 mL) o 5 mL (tubo cónico de 15 mL) de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Centrifugar el tubo a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 min. Retire el PBS sin alterar el pellet de la celda.
- Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de RPMI 1640 fresco + 10% FBS.
- En un nuevo matraz T25 se colocan 4 mL de medio calentado y se añaden las células resuspendidas del punto 1.2.5. Cultivo en una incubadora de 37 °C + 5% de CO2 hasta que las células requieran paso (normalmente 3 días), o hasta que se requieran células para un experimento.
- Para un experimento con macrófagos derivados de THP-1, retire el número requerido de células del matraz y la placa antes de pasar:
- Coloque el número requerido de cubreobjetos de vidrio circulares de 18 mm (# 1.5 de grosor) en los pocillos de una placa de 12 pocillos, generalmente 1 cubreobjetos por condición y/o punto de tiempo. En cada pocillo alícuota 5 x 104 monocitos THP-1. El número de celdas añadidas a cada pocillo puede modificarse si es necesario.
- Aumente el volumen total de cada pocillo que contiene celdas a 1 mL usando RPMI + 10% FBS calentado a 37 °C.
- Añadir 100 nM de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a cada pocillo y cultivar durante 3 días para inducir la diferenciación de los monocitos THP-1 en células similares a los macrófagos.
2. Cultivo y preparación de la línea celular de macrófagos J774.2
- Cultivo de células J774.2 en matraces T25 a 37 °C + 5% CO2. Las células deben cultivarse en 5 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS y pasar una vez que el cultivo alcance el 80-90% de confluencia. A las celdas de paso:
- Retire todos los medios del matraz y levántelo una vez con 5 ml de PBS.
- Retire el PBS del matraz y reemplácelo con 5 mL de DMEM fresco + 10% de FBS.
- Con un raspador de células, raspe el fondo del matraz para suspender las células en el medio. Pipetea vigorosamente las células varias veces para romper los agregados celulares.
- Diluya las células 1:5 retirando 4 mL de la suspensión celular del matraz y sustituyéndola por 4 mL de medio fresco. La suspensión celular restante se puede desechar, usar para iniciar un nuevo cultivo celular en un matraz T25 nuevo o usar para un experimento.
- Para preparar un ensayo de eferocitosis con células J774.2:
- Un día antes del inicio del experimento, suspenda las células J774.2 en 5 ml de medio fresco, según los pasos 1.1.1-1.1.3. Cuente las células con un hemocitómetro y prepare el volumen necesario de células a una concentración de 5 x 104 células/mL.
- Coloque el número necesario de cubreobjetos de vidrio circulares de 18 mm (# 1.5 de grosor) en los pocillos de una placa de 12 pocillos. En cada pocillo alícuota 1 mL de la suspensión de 5 x 104 células/mL de celda.
- Cultive durante la noche para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos y se recuperen del paso.
3. Cultivo de macrófagos M2 humanos primarios
- Recoja 10 ml de sangre humana heparinizada por cada placa de 12 pocillos de macrófagos M2 necesaria.
- En un tubo de centrífuga de 15 mL, superponga 5 mL de sangre humana sobre 5 mL de medio de separación de células linfolíticas y policélulas precalentadas. Prepare varios tubos si procesa >5 ml de sangre en lugar de usar tubos de mayor volumen.
- Centrifugar a 300 x g durante 35 min, utilizando una aceleración media y sin pausa.
- Retire con cuidado la banda superior rica en células mononucleares con una pipeta de plástico y transfiérala a un tubo de centrífuga de 50 ml. Si se prepararon varios tubos en el paso 3.2, las bandas se pueden agrupar en un solo tubo de 50 ml. Lleve el volumen del tubo hasta 50 mL con PBS.
- Centrifugar a 300 x g durante 8 min y retirar el sobrenadante. Durante este paso, coloque cubreobjetos circulares de 18 mm de diámetro esterilizados en autoclave (# 1.5 de grosor) en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
- Vuelva a suspender el pellet de celda en 300 μL de RPMI 1640 sin suero por número deseado de pocillos; Por ejemplo, si se procesaron 10 mL de sangre para preparar una placa completa de 12 pocillos, suspenda el pellet de células en 3,6 mL de medio.
- Agregue 300 μL de la suspensión celular a cada pocillo que contenga cubreobjetos en la placa de 12 pocillos. Incubar durante 1 h a 37 °C + 5% CO2.
- Lave suavemente el cubreobjetos 3 veces con 1 ml de PBS tibio para eliminar las células no adherentes.
- Añadir 1 mL de RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL de M-CSF humano recombinante + antibiótico/antimicótico para cultivo celular. Incubar a 37 °C + 5% de CO2 durante 5 días.
- Reemplace el medio con RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL de M-CSF humano recombinante + 10 ng/mL de IL-4 humana recombinante + antibiótico/antimicótico de cultivo celular. Incubar a 37 °C + 5% de CO2 durante 2 días para completar la polarización M2.
- Los macrófagos polarizados deben usarse dentro de los próximos 3 días.
4. Preparación de células Jurkat apoptóticas
- Cultivo de células Jurkat en 5 mL de RPMI 1640 + 10% FBS a 37 °C + 5% CO2. Los Jurkats son una línea celular de suspensión y se pueden mantener pasándolos 1:5 a medios frescos y precalentados cada 3 a 5 días.
- Para preparar las células apoptóticas, permita que el cultivo de Jurkat crezca a alta densidad (4-5 días después del paso). Alícuota 1,5 mL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y celdas de pellets por centrifugación a 500 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de medio RPMI 1640 sin suero que contenga 1 μM de estaurosporina.
- Incubar 16 h a 37 °C + 5% de CO2 para hacer que las células sean apoptóticas.
- Si lo desea, confirme la inducción de la apoptosis mediante tinción con anexina V:
- Alícuota 100 μL de cultivo celular Jurkat tratado con estaurosporina en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Células de pellet por centrifugación a 500 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de la célula en 100 μL de medio RPMI 1640 sin suero.
- Añadir 1 μL de anexina V conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Agregue 900 μL de PBS y transfiera todo el volumen a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos que contenga un cubreobjetos de vidrio circular de 18 mm (espesor #1.5). Gire hacia abajo en una centrífuga equipada con un adaptador de placa a 200 x g durante 1 minuto para forzar a las células a adherirse al cubreobjetos. Alternativamente, las células se pueden colocar en un portaobjetos con cámara para la obtención de imágenes.
- Imagen con un microscopio de fluorescencia.
5. Cuantificación de la absorción y la dinámica eferocítica mediante un ensayo de eferocitosis de células fijas y tinción de adentro hacia afuera
- Prepare macrófagos humanos THP-1, J774.2 o M2 como se describe en las secciones 1 a 3, respectivamente.
- La noche anterior al inicio del experimento, prepare células Jurkat apoptóticas como se describe en la sección 4.
- Inmediatamente antes del experimento, cuente las células apoptóticas con un hemocitómetro. Transfiera un número suficiente de células apoptóticas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL: generalmente agregamos 5 x 105 células/pocillo, lo que proporciona una relación objetivo:eferocitos de 10:1.
- Pellet de células Jurkat por centrifugación a 500 x g durante 5 min y resuspender en 500 μL de PBS.
- Durante la centrifugación, alícuota 10 μL de DMSO en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Disolver en el DMSO una cantidad mínima de N-hidroxisuccinimidobitina (NHS-Biotina). 5-10 cristales (~0,005 mg) son suficientes.
- Transfiera la suspensión de 500 μL de célula apoptótica/PBS al tubo que contiene DMSO/NHS-biotina. A continuación, diluya un tinte de seguimiento celular a la concentración recomendada por el fabricante en la suspensión celular apoptótica. Asegúrese de seleccionar un colorante de rastreo celular que no se superponga espectralmente con FITC-Streptavidin (por ejemplo, tinte de rastreo de glóbulos rojos o rojos lejanos).
- Incubar la suspensión durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Agregue un volumen igual de RPMI 1640 + 10% FBS e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad para apagar cualquier tinte sin reaccionar.
- Células pellet por centrifugación a 500 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células apoptóticas teñidas en 100 μL de RPMI 1640 + 10% FBS por pocillo de macrófagos.
- Añadir 100 μL de suspensión celular apoptótica teñida gota a gota a cada pocillo de macrófagos. Centrífuga de 200 x g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa para forzar el contacto entre macrófagos y células apoptóticas.
- Placa de incubación durante el período de tiempo deseado a 37 °C + 5% de CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos. En el caso de los macrófagos, el material eferrocitosado suele detectarse por primera vez a los 20-30 minutos y se completa a los 120-180 minutos.
- En el momento o puntos deseados, retire las células de la incubadora. Lave las células dos veces con 1 mL de PBS a temperatura ambiente para detener la eferocitosis y eliminar las células apoptóticas no eferrocitosadas.
- Agregue estreptavidina conjugada con FITC en una dilución de 1:1,000 a cada pocillo e incube durante 20 minutos en la oscuridad. Esto etiquetará la biotina expuesta en cualquier material celular apoptótico no eferrocitosado.
nota: Si se desea, los núcleos celulares se pueden teñir durante este paso mediante la adición de una dilución 1:20.000 de Hoechst 33342 o 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, diclorhidrato (DAPI).
- Lave las celdas 3 veces con 1 ml de PBS, agitando o meciendo suavemente las muestras durante 5 minutos por enjuague. Fije las celdas con 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Enjuague las células una vez con PBS para eliminar el exceso de PFA.
- Monte los cubreobjetos en un portaobjetos para obtener imágenes y transferirlos a un microscopio de fluorescencia. Capture pilas z de un número suficiente de celdas para una cuantificación precisa, generalmente de 10 a 30 celdas por condición. El material celular apoptótico no internalizado será evidente en la imagen resultante como material marcado con colorante de seguimiento celular envuelto por tinción con estreptavidina FITC, mientras que el material eferocitado forma puntos de colorante de rastreo celular discretos libres de cualquier tinción de estreptavidina.
- Cuantifique la eferocitosis en las imágenes resultantes a través de una variedad de medidas:
- Calcule el índice eferocítico determinando el número promedio de eferosomas discretos (colorante de seguimiento celular + / estreptavidina-puncta) por macrófago. Cuantificar solo macrófagos unidos a una célula apoptótica o que contienen ≥1 eferosomas visibles. Los macrófagos registrados unidos a una célula apoptótica, pero que carecen de eferosomas discretos, tienen un índice eferocítico de 0.
- Calcule la eficiencia eferocítica midiendo la fracción de macrófagos que contienen ≥1 eferosoma.
- Calcule la tasa de eferrocitosis mediante la obtención de imágenes de células fijadas y teñidas en múltiples puntos temporales. Solo imagen de macrófagos unidos a células apoptóticas, o que contienen eferosomas visibles, con pilas z capturadas de cada célula. Una vez obtenida la imagen, determinar la tasa de eferrocitosis:
- Utilizando la tinción de estreptavidina como guía, y la herramienta de selección a mano alzada o de polígonos en FIJI/ImageJ (u otro paquete de software de análisis de imágenes), encierre en un círculo todo el material de colorante de seguimiento de células +/estreptavidina (por ejemplo, internalizado) en un solo plano de la pila z. Mida la intensidad integrada del tinte de seguimiento celular en esta región. Las medidas individuales para cada eferosoma (por ejemplo, diámetro, posición en relación con el borde o el núcleo de la célula, etc.) se pueden adquirir fácilmente simultáneamente con estas mediciones, lo que aumenta en gran medida los datos recopilados durante el análisis.
- En la misma sección z, utilizando la tinción con estreptavidina como guía y la herramienta de selección a mano alzada o de polígonos, encierre en un círculo todo el material de colorante de seguimiento celular + / estreptavidina + (por ejemplo, no internalizado) en un solo plano de la pila z. Incluir únicamente la tinción de células apoptóticas en contacto con el fagocito. Medir la intensidad integrada de esta región.
- Repita los pasos 4.2.3.1 a 4.2.3.2 para las secciones z restantes de la imagen. Suma la intensidad integrada de los materiales eferrocitosados (Σeff) y no eferrocitosados (Σne). La fracción de la célula apoptótica que ha sido eferrocitosa se puede calcular para la célula como:
- Cuantificar la fracción eferrocitosa para todas las células en todos los puntos temporales. Tenga en cuenta que la intensidad fluorescente de las células/eferosomas apoptóticos puede variar entre imágenes debido a las variaciones en la absorción de los colorantes de seguimiento celular por parte de las células apoptóticas individuales y debido a cambios en los parámetros de adquisición de imágenes, como el tiempo de exposición. Como tal, solo compare los valores normalizados, como la fracción eferrocitosa, o los valores independientes de la intensidad, como el índice eferocítico y la eficiencia eferocítica, entre imágenes, entre condiciones experimentales y entre experimentos repetidos.
- Para asegurarse de que el conjunto de datos resultante refleja con precisión la variación de la eferocitosis entre las células, realice estos análisis en el máximo número posible de células en cada experimento><.
nota: La eficiencia eferocítica y el índice eferocítico se pueden calcular rápidamente (unos pocos segundos por celda) y, por lo general, nuestro objetivo es analizar al menos 100 células por experimento, repitiendo cada experimento al menos 3 veces. El cálculo de la fracción de material eferrocisado y las medidas específicas del eferosoma son más laboriosos, por lo general toman de 2 a 3 min/celda para un analista experimentado. Para estos cálculos, cuantificamos un mínimo de 15 celdas por condición, por experimento.
- Registre el índice eferocítico, la fracción eferocitada y los datos de eferosoma individual por célula.
nota: Esto permite el análisis de datos utilizando enfoques de una sola célula, lo que permite cuantificar las variaciones entre células. Los análisis a nivel de población aún se pueden realizar en estos conjuntos de datos promediando los datos de una sola célula adquiridos en experimentos individuales. Las mediciones específicas de eferosomas se pueden analizar a nivel de población, a nivel de una sola célula y como conjuntos (por ejemplo, como poblaciones de eferosomas independientes de las células que los contienen).