Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de los medios
- Agregue todos los componentes, como se describe en la Tabla 1, para formar el medio básico de recolección de ovocitos y el medio de maduración de ovocitos. Para el medio de recolección básico, ajuste el pH a 7.4. Tanto para el medio de recolección como para el de maduración, añadir 3 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y 1 μM de cilostamida el día de su uso.
2. Preparación de la codificación de ARNm para Ypet-3' UTR y mCherry
- Obtener las secuencias UTR 3' de los ARNm de interés.
nota: Para este estudio, se obtuvieron secuencias previamente a partir de ADNc de ovocitos de ratón.
- Diseñe cebadores para amplificar las UTR 3' diana a partir de ADNc de ovocitos y partes del vector pcDNA 3.1 que contienen una secuencia codificante Ypet, una etiqueta de epítopo V5 y un promotor T7.
- Amplifique con un kit de ADN polimerasa de alta fidelidad. Ejecute los productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un gel para verificar si los fragmentos tienen el tamaño correcto, corte las bandas y extraiga el ADN del gel usando un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Fusionar los fragmentos de PCR en un vector utilizando un kit de clonación de PCR.
nota: Los fragmentos de PCR se incubaron en hielo durante 4 h para facilitar un proceso de recombinación más eficiente. Esto es contrario a las instrucciones del fabricante, que recomienda un tiempo de incubación de solo 45 min.
- Transfecte fragmentos de PCR en bacterias Escherichia coli 5-α competentes.
- Agregue la mezcla y el plásmido a las bacterias e incube en hielo durante 30 minutos.
- Realice un choque térmico de la mezcla y el plásmido colocando la mezcla en un baño de agua a 42 °C durante 45 s, y enfríe inmediatamente en hielo durante 3 min.
- Añadir 500 μL de caldo Super Optimal con medio de represión de Catabolito (SOC) e incubar durante 1 h a 37 °C.
- Girar a 7000 × g durante 2 minutos y eliminar la mayor parte del sobrenadante. Vuelva a suspender y coloque en una placa de agar Luria Caldo (LB) con el antibiótico de selección adecuado.
nota: En este estudio se utilizó carbenicilina.
- Incubar durante la noche a 37 °C. Aislar las colonias presionando ligeramente la punta de una pipeta sobre una de las colonias y colocándola en medio LB de 3 mL con 100 μg/mL de carbenicilina. Incubar durante 12-24 h a 37 °C.
- Extraiga el ADN de los plásmidos utilizando el kit de aislamiento de ADN plasmídico de acuerdo con las instrucciones del fabricante y confirme las secuencias mediante secuenciación de ADN.
- Para Ypet/3' UTR:
- Producir una plantilla de PCR lineal para la transcripción in vitro. Utilice un cebador delantero aguas arriba de la secuencia Ypet y un cebador inverso con 20 residuos de timina adicionales. Véase la Tabla 2 para la secuencia de Ypet/IL-7 3' UTR y las secuencias de los cebadores de avance e inverso.
nota: Estos residuos adicionales de timina agregarán oligo(A) al ARNm lineal después de la transcripción in vitro.
- Transcribir in vitro el producto de PCR utilizando un kit de transcripción T7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Purifique el ARN complementario (ARNc) resultante utilizando un kit de limpieza de transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Eluir el ARNc purificado en agua libre de ARNasa, medir la concentración y evaluar la integridad mediante electroforesis de agarosa. Almacenar a -80 °C.
- Para mCherry:
- Producir una plantilla de PCR lineal para la transcripción in vitro mediante el uso de una enzima de restricción de alta fidelidad; utilice la enzima de restricción mfEI-HF si replica este ejemplo. Digierir en un tampón de digestión durante la noche a 37 °C.
- Ejecute un gel para purificar la muestra y extraiga el ADN lineal utilizando un kit de extracción en gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Transcribir in vitro el producto de PCR utilizando un kit de transcripción T7 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Poliadenilato el ARNc (150-200 nucleótidos) utilizando un kit de relaves de poli(A) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Purifique el ARNc resultante utilizando un kit de limpieza de transcripción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Eluir el ARNc purificado en agua libre de ARNasa, medir las concentraciones de ARNm y evaluar la integridad del mensaje mediante electroforesis en gel. Almacenar a -80 °C.
3. Procedimiento experimental
NOTA: En la Figura 1 se ofrece una visión general esquemática de la microinyección de ovocitos y la posterior microscopía de lapso de tiempo.
- Día 1
- Inyectar intraperitonealmente a ratones de 21 días de edad 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada para promover el crecimiento del folículo hasta la etapa antral.
- Día 3
- Colección de ovocitos
- Abra con cuidado los folículos antrales haciendo un pequeño corte en la pared del folículo con una aguja de 26 G. Aísle ovocitos intactos encerrados en cúmulos (COC) con varias capas de células cúmulos utilizando una pipeta de vidrio operada por la boca.
- Utilice una pipeta más pequeña (ligeramente mayor que el diámetro del ovocito) y desnude mecánicamente los AOC mediante pipeteo repetido.
nota: Alternativamente, realice la microinyección en AOC intactos.
- Con una pipeta más grande, aspire los ovocitos desnudados y colóquelos en una placa de Petri con un medio de maduración suplementado con 1 μM del inhibidor de la fosfodiesterasa, cilostamida, para evitar la reanudación de la maduración meiótica. Colocar la placa en la incubadora durante 2 h para que los ovocitos se recuperen del estrés inducido por el aislamiento de los ovocitos de los folículos.
- Microinyección de ovocitos
- Prepare las agujas de inyección colocando un tubo capilar de vidrio de borosilicato de 10 cm de largo en un extractor mecánico. Para una inyección óptima, doble la punta de la aguja en un ángulo de 45° con un filamento calentado.
- Prepare placas de poliestireno con gotas de 20 μL de medio básico de recolección de ovocitos y cubra las gotas con aceite mineral ligero.
- Prepare una mezcla reportera añadiendo 12,5 μg/μL de Ypet-3' UTR y 12,5 μg/μL mCherry. Prepare un volumen mayor y haga alícuotas para futuros experimentos para asegurar concentraciones reporteras similares. Almacene estas alícuotas a -80 °C. Al descongelar, primero centrifugue la alícuota durante 2 minutos a 20,000 x g y transfiérala a un nuevo tubo de microcentrífuga.
nota: Esta centrifugación evitará que la aguja de inyección se obstruya por posibles agregados en la mezcla reportera.
- Cargue la aguja de inyección por capilaridad con aproximadamente 0,5 μL de mezcla reportera.
- Coloque la pipeta de retención y la aguja de inyección cargada en los soportes y colóquela en la gota del medio de recolección de ovocitos. Aspire parte del medio en la pipeta de sujeción.
- Abra la aguja de inyección golpeándola suavemente contra la pipeta de sujeción.
- Coloque los ovocitos en una gota de medio de recolección básico e inyecte 5-10 pL de la mezcla reportera.
- Incubar los ovocitos en el medio de maduración con 1 μM de cilostamida durante 16 h para permitir que la señal de mCherry se estabilice.
- Prepare una placa de Petri que se utilizará para la microscopía de lapso de tiempo con al menos dos gotas de 20 μL de medio de maduración para cada indicador inyectado: una gota con 1 μM de cilostamida para los ovocitos de control de profase I y una gota sin cilostamida para los ovocitos en maduración. Cubra las gotas con aceite mineral ligero y colóquelas en la incubadora.
- Microscopía time-lapse
- Después de la preincubación, retire los ovocitos inyectados de la incubadora y lávelos cuatro veces en medio de maduración sin cilostamida. Mantener algunos ovocitos en medio de maduración con 1 μM de cilostamida como grupo control de ovocitos detenidos por profase I.
- Transfiera los ovocitos inyectados a sus respectivas gotitas en la placa de microscopio time-lapse previamente preparada. Agrupe los ovocitos utilizando una pipeta de vidrio cerrada (se puede preparar una pipeta cerrada manteniendo la punta en una llama durante unos segundos).
nota: La agrupación de los ovocitos ayuda a evitar su movimiento durante el registro.
- Coloque la antena bajo el microscopio equipado con un sistema de iluminación de diodos emisores de luz y una platina motorizada equipada con una cámara ambiental mantenida a 37 °C y 5% de CO2. Para replicar este estudio, utilice los siguientes parámetros: conjunto de filtros: espejo dicroico YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitación (Ex): S500/20 × 49057; Emisión (EM): D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em: 632/60 m).
- Introduzca la configuración adecuada para el experimento de lapso de tiempo (consulte la Tabla de materiales para el software utilizado en este estudio): Haga clic en Aplicaciones | Adquisición multidimensional. Seleccione la primera pestaña Principal y seleccione lapso de tiempo, múltiples posiciones de escenario y múltiples longitudes de onda.
- Seleccione la pestaña Guardar para introducir la ubicación en la que se debe guardar el experimento.
- Seleccione la pestaña Timelapse para introducir el número de puntos de tiempo, la duración y el intervalo de tiempo.
nota: La duración del experimento de lapso de tiempo depende de la especie animal estudiada, ya que el momento de la maduración meiótica de los ovocitos difiere entre las especies. En este experimento con ovocitos de ratón, se registraron ovocitos cada 15 min durante 16 h.
- Seleccione la pestaña Etapa. Encienda el campo claro y localice la posición de los ovocitos abriendo una nueva ventana seleccionando Adquirir | Adquirir | Espectáculo en vivo. Una vez localizados los ovocitos, vuelva a la ventana de adquisición multidimensional y pulse + para establecer la ubicación de los ovocitos.
- Seleccione la pestaña Longitudes de onda y establezca 3 longitudes de onda diferentes para campo claro (exposición de 15 ms), YFP (exposición de 150 ms para Ypet/IL7 3' UTR) y mCherry (exposición de 75 ms para Ypet/IL7 3' UTR).
nota: Ajuste la exposición de cada reportero UTR Ypet/3' en función del nivel de acumulación de reporteros y el volumen inyectado. Asegúrese de que la señal YFP caiga en el centro del rango de detección al comienzo del experimento para evitar la subestimación o la saturación en caso de activación de la traducción. Para mCherry, ajuste la exposición para cada lote de mCherry, ya que la señal depende del número de nucleótidos de adenina que se agregaron durante el procedimiento de poliadenilación. Debido a la variación en la eficiencia de la poliadenilación, utilice el mismo lote de mCherry en diferentes experimentos para una mejor comparación entre experimentos.
- Inicie el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en Adquirir. Véase la Figura 1 para ver un ejemplo de una grabación time-lapse en un solo ovocito.
- Análisis de la traducción UTR de Ypet-3'
- Para este análisis (ver Tabla de Materiales para el software utilizado en este estudio), se realizan dos mediciones de región para cada ovocito: el ovocito en sí mismo -clic en la región de la elipse y alrededor del ovocito- y una pequeña región cercana al ovocito que se utilizará para la sustracción de fondo -clic en la región rectangular-
nota: Asegúrese de que los ovocitos no se muevan fuera de la región seleccionada durante la grabación en time-lapse. Preste especial atención a la ubicación de la medición de la región alrededor de la extrusión del cuerpo polar, ya que esto provoca movimiento en el ovocito y puede distorsionar el registro.
- Exporte los datos de medición de la región a una hoja de cálculo haciendo clic primero en Abrir registro y luego en Datos de registro para exportar el software de análisis de datos.
- Para cada ovocito individual y para todos los puntos de tiempo medidos, reste la medición de la región de fondo de la medición de la región del ovocito. Haga esto para las longitudes de onda YFP y mCherry por separado.
Tabla 1: Preparación de los medios. Lista de componentes que deben agregarse para preparar el medio básico de recolección de ovocitos y el medio de maduración de ovocitos.
| Medio básico de recolección de ovocitos | |
| componente | Para 500 mL |
| HEPES modificado Mínimo Esencial Medio Águila | 7,1 g |
| Bicarbonato de sodio | 252 mg |
| Piruvato de sodio | 1.15 mL |
| Penicilina/Estreptomicina 100x | 5 mL |
| Agua destilada ultrapura (Invitrogen, 10977-015) | Hasta 500 ml |
| Medio de maduración | |
| componente | Para 500 mL |
| MEM alfa 1x | Hasta 500 ml |
| Piruvato de sodio | 1.15 mL |
| Penicilina/Estreptomicina 100x | 5 mL |
Tabla 2: Ejemplo de secuencias reporteras y cebadoras Secuencia de reporteros YFP/IL7 3'UTR y secuencias de cebadores directos e inversos que se utilizaron para producir una plantilla de PCR lineal para la transcripción in vitro.
| secuencia |
| Ypet/Interleucina-7 3' UTR | GAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGGTCGCACCATGGTGAGCAAAGGCGAAGAGCTGTTCACC
GGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGACGGCGACGGGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGCGACGACCACCTACGGCAAGCTGACCGAAGCTGCTGGETCCACCGGCAAGCTG
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| Imprimación directa | GAGAACCCACTGCTTAC |
| Imprimación inversa | TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAAATATTATCTTTTTTTTGCCAAAATC |
