NOTA: Se utilizó la línea de laboratorio estándar Oregon R como control de WT. Todas las moscas se criaron en un medio estándar de harina de maíz y melaza (que contenía melaza, agar, levadura, harina de maíz, tegosept, ácido propiónico y agua) a temperatura ambiente con un ritmo circadiano claro/oscuro de 12/12 h.
1. Preparación para el ensayo
- Recoja moscas hembra (de 0 a 2 días de edad, no vírgenes) bajo anestesia con CO2 y permita que se recuperen con alimento estándar de harina de maíz durante al menos 3 días antes de los experimentos.
- Privar a las moscas de la cama durante ~24 h a temperatura ambiente (~23 °C) en viales que contengan un pañuelo de laboratorio empapado con ~2 mL de agua desionizada.
- Prepare el alimento para moscas con azul de bromofenol (BPB) de la siguiente manera:
- Derrite la comida para moscas en un microondas y luego déjala enfriar hasta que esté tibia.
- Agregue 1 mL de BPB al 4% a 1 mL de alimento tibio y mezcle bien.
- Con una pipeta, agregue el alimento para moscas que contiene BPB en un solo punto (~ 200 μL) en el centro de una placa de Petri.
2. Ensayo de control de la acidificación intestinal
- Transfiera las moscas hambrientas a una placa de Petri que contenga puntos individuales (200 μL) de alimento para moscas complementado con azul de bromofenol (BPB) al 2%. Deje que las moscas se alimenten durante 4 horas a temperatura ambiente mientras están expuestas a la luz.
- Después de 4 h, recoger las moscas y anestesiarlas en hielo; aislar quirúrgicamente sus intestinos.
- Realice la cirugía en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x con pinzas bajo un microscopio estereoscópico (consulte la Tabla de materiales). Aísle el intestino sosteniendo el tórax con un par de pinzas y tirando hacia abajo del abdomen con un segundo par hasta que el CCR del intestino sea visible, teniendo cuidado de asegurarse de que el intestino permanezca unido en ambos extremos.
- Determine la acidificación del intestino examinando el color del CCR del intestino (Figura 1C; el amarillo indica acidificado y el azul indica no acidificado).
- Cuente solo aquellas moscas que muestran una tinción robusta de BPB en sus intestinos.
- Calcule el porcentaje utilizando la siguiente ecuación:
Porcentaje de moscas con intestinos acidificados = número de moscas acidificadas × 100 / (número de moscas acidificadas + número de moscas no acidificadas)
nota: Un porcentaje de 0 indica que ninguna mosca acidificó su intestino, mientras que un porcentaje de 100 indica que todas las moscas acidificaron su intestino.
