Ensayo de absorción de calcio mitocondrial: un método basado en lectura de placas para medir la absorción de calcio en mitocondrias aisladas

1. Reactivos y soluciones

1. Producir 500 mM de tampón MS-EGTA para el aislamiento mitocondrial: 225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa, 5 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 1 mM de etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N'-ácido tetraacético (EGTA), pH ajustado a 7,4 con KOH. Esterilícelo a través de un filtro de 0,22 μm y guárdelo a 4 °C. Asegúrese de que el tampón MS-EGTA esté preenfriado a 4 °C antes de usarlo.
2. Prepare 100 mL de tampón KCl: 125 mM de KCl, 20 mM de HEPES, 1 mM de KH₂PO₄, 2 mM de MgCl₂, 40 μM de EGTA y pH ajustado a 7,2 con KOH. Guárdalo a temperatura ambiente.
3. Prepare 1 mM de caldo de calcio verde-5N en dimetilsulfóxido (DMSO). El caldo de calcio verde-5N puede alícuota y almacenarse a -20 °C.
4. Prepare los sustratos para la absorción de Ca²⁺.
   1. Prepare piruvato de sodio 1 M, pH 7.4. Guárdelo en alícuotas a -20 °C.
   2. Preparar 500 mM de malato, pH 7,4. Guárdelo en alícuotas a -20 °C.

2. Aislamiento de las mitocondrias cardíacas

1. Sacrificar al ratón de acuerdo con los estándares institucionales.
   nota: Para nuestro método de eutanasia aprobado institucionalmente, los ratones fueron anestesiados por inhalación de isofluorano y sacrificados por dislocación cervical.
2. Recoja el corazón abriendo la cavidad torácica, cortando a lo largo de cada lado de las costillas, flanqueando el corazón, cortando el diafragma y extirpando el tejido >nota: En este protocolo, el aislamiento mitocondrial se realiza a partir de un corazón entero recogido de un ratón adulto (aproximadamente 120 mg), lo que debería ser suficiente para 3-4 experimentos. Para el aislamiento mitocondrial de otros tejidos ricos en mitocondrias, como el hígado, se pueden utilizar hasta 200 mg de tejido siguiendo el protocolo descrito.
3. Enjuague bien el tejido con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada, asegurándose de que toda la sangre salga de los ventrículos.
   nota: El corazón estará suficientemente enjuagado cuando el líquido exprimido del corazón salga limpio.
4. Pica el corazón en trozos pequeños en 5 ml de 1x PBS helado con unas tijeras afiladas.
5. Deseche el PBS y transfiera el tejido cardíaco picado a un homogeneizador Dounce de vidrio y teflón de 7 ml preenfriado con un espacio libre de 0,10 a 0,15 mm.
6. Agregue 5 mL de tampón MS-EGTA helado y homogeneice la muestra hasta que las piezas de tejido ya no sean visibles (aproximadamente 11 golpes)
   nota: No homogeneice en exceso el tejido, ya que el objetivo es obtener mitocondrias intactas y funcionales.
7. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mL.
8. Centrifugar el homogeneizado a 600 x g a 4 °C durante 5 min para pellets núcleos y células intactas.
9. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 15 mL y centrifugue a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min para pellets mitocondrias.
10. Deseche el sobrenadante y mantenga la bolita mitocondrial en hielo.
11. Lave el gránulo mitocondrial dos veces con tampón MS-EGTA helado. Para cada lavado, vuelva a suspender el pellet mitocondrial en 5 mL de tampón MS-EGTA, centrifugue a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min y deseche el sobrenadante.
12. Después del lavado final, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las mitocondrias en 100 μL de tampón MS-EGTA helado. Mantenga las mitocondrias en hielo.
    nota: Las mitocondrias deben usarse para la experimentación dentro de 1 h.
13. Mida la concentración de proteínas mitocondriales mediante un ensayo de proteínas de Bradford.

3. Medición de la absorción de calcio mitocondrial basada en un lector de placas

NOTA: Aquí se describe el protocolo para analizar la absorción mitocondrial de Ca²⁺ utilizando un lector de placas multimodo equipado con inyectores. Se puede utilizar cualquier lector de placas con la capacidad de leer la fluorescencia de verde calcio-5N (excitación/emisión de 506/532 nm) en modo cinético con inyectores de reactivos automatizados para mantener la reacción protegida de la luz.

1. Programe el lector de placas para realizar una lectura cinética de la fluorescencia de verde-5N de calcio con mediciones tomadas cada segundo durante un tiempo total de ensayo de 1.000 s. Además, programe los inyectores de reactivos para dispensar 5 μL de solución de CaCl₂ en los puntos de tiempo de 30 s, 150 s, 300 s, 480 s y 690 s.
   nota: El momento de las inyecciones de CaCl₂ está definido por el usuario y se puede ajustar de acuerdo con las necesidades experimentales.
2. Prepare los inyectores de reactivo con la solución de CaCl₂ que se va a utilizar.
   nota: La concentración de la solución de CaCl₂ está definida por el usuario y se puede ajustar en ejecuciones posteriores para valorar la cantidad de Ca²⁺ necesaria para activar la apertura de MPTP.
3. Agregue 200 μg de mitocondrias a un pocillo individual de una placa de 96 pocillos.
4. Agregue el volumen apropiado de tampón KCl al pocillo de modo que el volumen total de mitocondrias y tampón KCl llegue a 197 μL.
5. Agregue 1 μL de piruvato 1 M y 1 μL de malato 500 mM a la mezcla de mitocondrias. Pipetear suavemente para mezclar e incubar las mitocondrias con los sustratos durante 2 minutos a temperatura ambiente para permitir que las mitocondrias se energizen.
6. Añadir 1 μL de 1 mM de caldo de calcio verde-5N. Mezclar suavemente pipeteando.
   nota: Proteja la reacción de la luz después de la adición del colorante verde calcio-5N.
7. Inicie el protocolo cinético preprogramado y controle la fluorescencia del verde calcio-5N.