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1. Reactivos y soluciones
- Producir 500 mM de tampón MS-EGTA para el aislamiento mitocondrial: 225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa, 5 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES), 1 mM de etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N'-ácido tetraacético (EGTA), pH ajustado a 7,4 con KOH. Esterilícelo a través de un filtro de 0,22 μm y guárdelo a 4 °C. Asegúrese de que el tampón MS-EGTA esté preenfriado a 4 °C antes de usarlo.
- Prepare 100 mL de tampón KCl: 125 mM de KCl, 20 mM de HEPES, 1 mM de KH2PO4, 2 mM de MgCl2, 40 μM de EGTA y pH ajustado a 7,2 con KOH. Guárdalo a temperatura ambiente.
- Prepare 1 mM de caldo de calcio verde-5N en dimetilsulfóxido (DMSO). El caldo de calcio verde-5N puede alícuota y almacenarse a -20 °C.
- Prepare los sustratos para la absorción de Ca2+.
- Prepare piruvato de sodio 1 M, pH 7.4. Guárdelo en alícuotas a -20 °C.
- Preparar 500 mM de malato, pH 7,4. Guárdelo en alícuotas a -20 °C.
2. Aislamiento de las mitocondrias cardíacas
- Sacrificar al ratón de acuerdo con los estándares institucionales.
nota: Para nuestro método de eutanasia aprobado institucionalmente, los ratones fueron anestesiados por inhalación de isofluorano y sacrificados por dislocación cervical.
- Recoja el corazón abriendo la cavidad torácica, cortando a lo largo de cada lado de las costillas, flanqueando el corazón, cortando el diafragma y extirpando el tejido >nota: En este protocolo, el aislamiento mitocondrial se realiza a partir de un corazón entero recogido de un ratón adulto (aproximadamente 120 mg), lo que debería ser suficiente para 3-4 experimentos. Para el aislamiento mitocondrial de otros tejidos ricos en mitocondrias, como el hígado, se pueden utilizar hasta 200 mg de tejido siguiendo el protocolo descrito.
- Enjuague bien el tejido con 25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x helada, asegurándose de que toda la sangre salga de los ventrículos.
nota: El corazón estará suficientemente enjuagado cuando el líquido exprimido del corazón salga limpio.
- Pica el corazón en trozos pequeños en 5 ml de 1x PBS helado con unas tijeras afiladas.
- Deseche el PBS y transfiera el tejido cardíaco picado a un homogeneizador Dounce de vidrio y teflón de 7 ml preenfriado con un espacio libre de 0,10 a 0,15 mm.
- Agregue 5 mL de tampón MS-EGTA helado y homogeneice la muestra hasta que las piezas de tejido ya no sean visibles (aproximadamente 11 golpes)
nota: No homogeneice en exceso el tejido, ya que el objetivo es obtener mitocondrias intactas y funcionales.
- Transfiera el homogeneizado a un tubo de 15 mL.
- Centrifugar el homogeneizado a 600 x g a 4 °C durante 5 min para pellets núcleos y células intactas.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo de 15 mL y centrifugue a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min para pellets mitocondrias.
- Deseche el sobrenadante y mantenga la bolita mitocondrial en hielo.
- Lave el gránulo mitocondrial dos veces con tampón MS-EGTA helado. Para cada lavado, vuelva a suspender el pellet mitocondrial en 5 mL de tampón MS-EGTA, centrifugue a 10.000 x g a 4 °C durante 10 min y deseche el sobrenadante.
- Después del lavado final, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las mitocondrias en 100 μL de tampón MS-EGTA helado. Mantenga las mitocondrias en hielo.
nota: Las mitocondrias deben usarse para la experimentación dentro de 1 h.
- Mida la concentración de proteínas mitocondriales mediante un ensayo de proteínas de Bradford.
3. Medición de la absorción de calcio mitocondrial basada en un lector de placas
NOTA: Aquí se describe el protocolo para analizar la absorción mitocondrial de Ca2+ utilizando un lector de placas multimodo equipado con inyectores. Se puede utilizar cualquier lector de placas con la capacidad de leer la fluorescencia de verde calcio-5N (excitación/emisión de 506/532 nm) en modo cinético con inyectores de reactivos automatizados para mantener la reacción protegida de la luz.
- Programe el lector de placas para realizar una lectura cinética de la fluorescencia de verde-5N de calcio con mediciones tomadas cada segundo durante un tiempo total de ensayo de 1.000 s. Además, programe los inyectores de reactivos para dispensar 5 μL de solución de CaCl2 en los puntos de tiempo de 30 s, 150 s, 300 s, 480 s y 690 s.
nota: El momento de las inyecciones de CaCl2 está definido por el usuario y se puede ajustar de acuerdo con las necesidades experimentales.
- Prepare los inyectores de reactivo con la solución de CaCl2 que se va a utilizar.
nota: La concentración de la solución de CaCl2 está definida por el usuario y se puede ajustar en ejecuciones posteriores para valorar la cantidad de Ca2+ necesaria para activar la apertura de MPTP.
- Agregue 200 μg de mitocondrias a un pocillo individual de una placa de 96 pocillos.
- Agregue el volumen apropiado de tampón KCl al pocillo de modo que el volumen total de mitocondrias y tampón KCl llegue a 197 μL.
- Agregue 1 μL de piruvato 1 M y 1 μL de malato 500 mM a la mezcla de mitocondrias. Pipetear suavemente para mezclar e incubar las mitocondrias con los sustratos durante 2 minutos a temperatura ambiente para permitir que las mitocondrias se energizen.
- Añadir 1 μL de 1 mM de caldo de calcio verde-5N. Mezclar suavemente pipeteando.
nota: Proteja la reacción de la luz después de la adición del colorante verde calcio-5N.
- Inicie el protocolo cinético preprogramado y controle la fluorescencia del verde calcio-5N.