1. Preparación de Vesículas Unilamelares Grandes (LUVs)
- Prepare los LUV para su uso como imitadores de la membrana celular para el ensayo de fuga de fluorescencia.
- Mezclar con una jeringa de vidrio Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786,11 g/mol), esfingomielina (SM, 760,22 g/mol) y colesterol (Chol, 386,65 g/mol) en la proporción molar 4:4:2. La solución lipídica se obtiene a partir de una solución madre de cada lípido solubilizada en un disolvente de metanol/cloroformo (3/1; volumen/volumen) a 25 mg/mL en un matraz de vidrio de fondo redondo de 25 mL. A partir de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM y 2 μmol de Chol, la solución lipídica se obtiene a partir de una solución madre mezclando 126 μL, 117 μL y 31 μL, respectivamente
cautela: El metanol es un disolvente tóxico e inflamable y el cloroformo es tóxico y cancerígeno. Ambos deben manipularse con la protección adecuada bajo un capó.
- Evaporar metanol/cloroformo utilizando un evaporador rotativo al vacío durante 45-60 min a 60 °C hasta la formación de una película lipídica seca.
- Prepare dos soluciones tampón HEPES en stock. Prepare el tampón HEPES 1 mezclando 20 mM HEPES (238,3 g/mol) y 75 mM de NaCl (58,44 g/mol) y ajuste el pH a 7,4. Prepare el tampón HEPES 2 mezclando 20 mM de HEPES y 145 mM de NaCl y ajuste el pH a 7,4. Los tampones HEPES pueden almacenarse a 4 °C durante 1 mes.
nota: Se recomienda comprobar la osmolaridad de los tampones con un osmómetro.
- Prepare la solución de hidratación lipídica disolviendo el par de tintes fluorescentes impermeables de membrana, el ácido 8-aminonaftaleno-1, 3, 6-trisulfónico, la sal disódica a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) y el bromuro de p-xileno-bispiridinio a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) en una solución tampón HEPES. La mezcla de ANTS con DPX conduce a una solución de color amarillo. Para alcanzar las concentraciones de 12,5 mM de ANTS y 45 mM de DPX, disuelva 21,4 mg y 76 mg, respectivamente, en 4 mL de tampón HEPES 1,
nota: La solución de hidratación lipídica puede almacenarse durante 2 semanas a 4 °C envolviendo el tubo con papel de aluminio.
- Reconstituir las vesículas multilaminares (MLV) resuspendiendo la película lipídica seca con 1 mL de la solución de hidratación lipídica y mediante vórtice hasta la disolución de la película lipídica seca. Asegúrese de que la solución esté completamente solubilizada, ya que los pequeños agregados de lípidos tendrán un impacto negativo en los pasos anteriores. Además, revise la pared del matraz de vidrio de fondo redondo para asegurarse de que no quede ninguna película lipídica.
nota: La solución aparecerá opalescente y de color amarillo claro después de la solubilización.
- Someter las vesículas a cinco ciclos de congelación/descongelación para obtener vesículas unilaminares. Realice cada ciclo colocando el matraz de vidrio de fondo redondo durante 30 s en nitrógeno líquido para la etapa de congelación, luego dejándolo en un baño de agua durante 2 minutos para la etapa de descongelación.
nota: La temperatura del agua del baño debe ser 5-10 °C más alta que la temperatura de fusión de los lípidos.
- Prepare la extrusora de lípidos insertando dos soportes de filtro humidificados preliminarmente con tampón HEPES en cada pieza de la extrusora de politetrafluoroetileno (PTFE) colocada en el recipiente metálico de la extrusora.
- Coloque una membrana de policarbonato humidificado HEPES (tamaño de poro de 0,1 μm, 25 mm de diámetro) en la parte superior de un soporte de filtro.
- Ensamble los dos botes metálicos de la extrusora y atorníllelos.
- Coloque el extrusor ensamblado en el soporte e introduzca una jeringa de 1 mL en el orificio apropiado en el extremo de cada pieza del extrusor de politetrafluoroetileno. La extrusión corresponde al paso del líquido ensayado de una jeringa a otra a través de la membrana de policarbonato.
- Pruebe el extrusor con 1 mL de tampón HEPES cargado en una de las jeringas de 1 mL para asegurarse de que no haya fugas ni problemas.
- Reemplace el tampón HEPES de 1 mL con la muestra MLV.
- Realice la extrusión haciendo pasar la muestra de MLV de una jeringa a otra a través de la membrana de policarbonato al menos 21 veces para obtener LUV uniformes del mismo tamaño.
nota: La extrusión debe realizarse a una temperatura superior a la temperatura de fusión de la mezcla de lípidos.
2. Purificación de LUVs
- Prepare una depuración de columna para eliminar el exceso de ANTS y DPX no encapsulados.
- Introducir gel de dextrano reticulado (G-50) resuspendido en medio acuoso con NaN3 al 0,01% (65 g/mol) en una columna de cromatografía líquida (Luer Lock, sin camisa, 1,0 cm x 20 cm, volumen del lecho 16 mL) hasta 1 cm por debajo de la parte superior de la parte incolora de la columna.
- Abra el grifo y deje que el líquido fluya para asentar el gel de dextrano reticulado.
- Lave la columna eluyendo con 20 mL de tampón HEPES 2 y deseche el caudal de salida de la columna.
- Cierre el grifo una vez que el volumen muerto de disolvente por encima de la columna se haya minimizado (<100 μL) pero suficiente para evitar cualquier secado del gel de dextrano reticulado.
- Coloque los LUV recién extruidos (amarillos) en la columna y déjelos entrar en el gel de dextrano reticulado.
- Agregue continuamente el tampón HEPES 2 a la columna para realizar la purificación del LUV.
- Eluir aproximadamente 2 mL de tampón HEPES 2 (no olvide llenar regularmente la parte superior de la columna para evitar secar el gel de dextrano reticulado): la solución amarilla libre de ANTS y DPX migra más lentamente que los liposomas.
- Comience a recolectar LUV purificados en tubos (1,5 mL).
- Observe las gotas de eluyente de la columna y cuando se vuelven opalescentes, contienen liposomas. Cambie el tubo para recuperar la fracción que contiene LUV.
- Eluir hasta que las gotas ya no sean opalescentes (~1 mL). A continuación, eluir otros 0,5 mL en una fracción separada y luego dejar de eluir.
NOTA: Los patrones ahora están disponibles en una amplia gama de pesos moleculares, como kits o pesos moleculares individuales para calibrar el volumen de elución de los LUV.
- Envuelva los tubos con los LUV en papel de aluminio para evitar el blanqueo del tinte de fluorescencia.
- Lave la columna con 20 ml de tampón HEPES 2.
- A continuación, los LUV pueden almacenarse durante una semana a 4 °C.
NOTA: Dado que la estabilidad del LUV puede depender de la concentración y composición del LUV, así como de la fuerza iónica, el tamaño de los LUV debe controlarse utilizando un instrumento de dispersión dinámica de la luz (DLS) (véase la sección 4. Caracterización del tamaño y homogeneidad del LUV) antes de cada prueba.
3. Cuantificar la concentración de LUVs
- Estimación de la concentración de LUV mediante un kit de cuantificación de fosfolípidos, que permite evaluar la concentración de colina. Este ensayo puede aplicarse cuando los fosfolípidos con colina que contienen cabeza polar son sustanciales (>50% de los LUV).
- Prepare el reactivo de color disolviendo 18 mg de sustrato de cromógeno en 3 mL de tampón suministrado.
- Cargue una cubeta de poliestireno, 10 x 10 x 45 mm, con 3 mL de reactivo de color.
- Utilice el reactivo de color puro como condición en blanco (Blank). Añadir 20 μL de muestra de LUV (Prueba) o 20 μL de solución patrón de concentración conocida de colina (Estándar).
- Mezclar bien e incubar durante 5 min a 37 °C en todas las condiciones (Blanco, Prueba y Estándar).
- Mida la absorbancia (densidad óptica, OD) de la muestra de prueba y la solución estándar con la solución en blanco como control a 600 nm con un espectrofotómetro.
- Comprobar los valores de OD que permiten estimar la concentración de lípidos de los LUVs, C[LUV], en equivalente de colina en comparación con el estándar de concentración conocida.
- Realice el cálculo utilizando la siguiente ecuación:
C[LUV] (mol / l) = (Muestra OD / OD Estándar) x C[Estándar] (mol / l)
NOTA: El kit de cuantificación de fosfolípidos proporcionó una solución estándar de cloruro de colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL correspondiente a la concentración molar de C[Estándar] = 3,87 mmol/L. La muestra OD y el patrón OD son las absorbancias medidas a 600 nm para las soluciones LUV y colina, respectivamente.
4. Caracterización del tamaño y homogeneidad del LUV
- Realice una medición utilizando un instrumento DLS para determinar el tamaño del LUV (en nm) y el índice de polidispersidad (PdI).
- Programe el "procedimiento de operación estándar" (SOP) apropiado indicando la viscosidad del solvente/tampón y la cubeta usada.
- Coloque 500 μL de la solución LUV en una semi-micro cubeta de poliestireno.
- Inserte la semi-micro cubeta de poliestireno en un instrumento DLS.
- A temperatura ambiente, mida la distribución del tamaño en términos de tamaño medio (Z-promedio) de la distribución de partículas y de homogeneidad (índice de polidispersidad, PdI).
- Todos los resultados se obtienen a partir de dos mediciones independientes realizadas cada una en tres ciclos repetitivos.
NOTA: Los valores estándar para los LUV tendrán un tamaño medio de 137 ± 7 nm con un PdI de 0,149 ± 0,041.
5. Preparación de soluciones peptídicas
- Prepare una solución madre del péptido, que debe analizarse para el ensayo de fugas.
- Disolver el péptido en polvo (>95% de pureza) en agua pura (por ejemplo, 1 mg de péptido en 500 μL de agua pura).
nota: Se recomienda diluir los péptidos en agua pura y evitar la solubilización del dimetilsulfóxido (DMSO), que podría inducir artefactos (por ejemplo, permeabilización de la membrana).
- Vórtice la solución peptídica durante 5 s.
- Sonicar la solución peptídica en un baño de sonicación con agua durante 5 min y luego centrifugar durante 5 min a 12.225 x g. Recoja el sobrenadante para la determinación de la concentración.
- Mida la absorbancia a 280 nm de tres diluciones de péptidos independientes y luego calcule la concentración de péptidos utilizando su coeficiente de extinción molar ε (dependiendo del contenido de triptófano y tirosina en la secuencia peptídica) y la regla de Beer-Lambert><.
nota: Si el péptido contiene triptófano y tirosina, el coeficiente de extinción molar ε se calcula sobre la base de la ε de triptófano = 5.690 M-1 cm-1 y la tirosina ε = 1.280 M-1 cm-1. Si la secuencia peptídica no contiene triptófano ni tirosina, se puede realizar otro ensayo colorimétrico para medir la concentración (por ejemplo, BCA o Bradford).
- Diluir la solución peptídica en agua pura hasta obtener una solución final de 100 μM y almacenar a 4 °C.
nota: En el agua pura, no se produce degradación de péptidos durante el almacenamiento a 4 °C. Sin embargo, la concentración de péptidos debe medirse cada 2 semanas para garantizar que no se produzca evaporación del agua.
6. Ensayo de fuga de fluorescencia
- El ensayo de fuga de fluorescencia se mide en un espectrofluorómetro a temperatura ambiente. La longitud de onda de excitación y emisión se fija en Ex = 360 nm ± 3 nm y Em = 530 nm ± 5 nm, respectivamente.
- Diluir los LUV en 1 mL de tampón HEPES 2 hasta una concentración final de 100 μM en una cubeta de fluorescencia de cuarzo. Agregue un agitador magnético para homogeneizar la solución durante el experimento.
- Mida los LUV solos durante los primeros 100 s, entre t = 0 s y t = 99 s para acceder a la fluorescencia de fondo.
nota: Los LUV solos también se pudieron medir durante todo el experimento (15 min) para acceder a la fluorescencia de fondo y a las posibles fugas.
- A partir de entonces, mida la fuga como un aumento en la intensidad de la fluorescencia tras la adición de alícuotas de solución peptídica durante los siguientes 900 s (15 min). Este protocolo se lleva a cabo para cada concentración de péptido ensayada de 0,1 μM a 2,5 μM.
- Finalmente, se logró una fluorescencia del 100% solubilizando los LUV mediante la adición de 1 μL de Triton X-100 (0,1%, v/v), lo que resultó en la sonda completamente no apagada entre t = 1.000 s y t = 1.100 s.
7. Cuantificación de la fuga
- Suprime los valores obtenidos después de t = 1.090 s para mantener el mismo número de puntos para cada condición probada.
- Calcule la fluorescencia mínima, Fmin, haciendo el promedio de 50 puntos entre t = 0 s y t = 49 s (LUV solos).
- Calcule la fluorescencia máxima, Fmáx, haciendo el promedio de 50 puntos entre t = 1.041 s y t = 1.090 s (LUV con Triton X-100).
- Calcule el porcentaje de fuga (%Leak) en cada punto de tiempo (t = x), de acuerdo con la siguiente ecuación:
%Fuga(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
- Calcule el promedio y la desviación estándar para los valores obtenidos con diferentes preparaciones de LUV (n ≥ 2) para la misma condición.
- Traza el porcentaje de fuga, %Leak(t=x), en función del tiempo (s).
