Ensayo de proteínas solubles para cuantificar el contenido de proteínas solubles en tejidos vegetales

1. Recolección y procesamiento de plantas

1. Recolectar y procesar muestras de plantas
   1. Después de recoger muestras de plantas, congele rápidamente las muestras sumergiendo el material vegetal en nitrógeno líquido con pinzas y guárdelas a -80 °C. Si las muestras de plantas recolectadas son demasiado grandes para congelarlas rápidamente, enfríe rápidamente las muestras con hielo seco y transfiéralas a un congelador de -80 °C lo antes posible. El contenido de macronutrientes del material vegetal puede cambiar después de que los tejidos se separan de la planta, por lo que es importante congelar las muestras de plantas lo antes posible después de la recolección><. PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido puede causar congelación severa cuando entra en contacto con la piel. Asegúrese de transportar el nitrógeno líquido en recipientes aprobados y use el EPP adecuado durante su manipulación, incluidos guantes criogénicos, gafas protectoras, protector facial, delantal y una bata de laboratorio.
   2. Liofililice el material vegetal con un liofilizador para asegurarse de que los tejidos estén metabólicamente inactivos mientras se elimina el agua. Seque hasta que la masa de la muestra se estabilice para asegurarse de que se haya eliminado toda el agua.
   3. Una vez que las muestras estén secas, muela hasta obtener un polvo fino con un molinillo o molino. Almacene las muestras en un gabinete de desecación hasta el análisis.

2. Ensayo de proteínas solubles

1. Preparación de la muestra
   1. Pese muestras replicadas de cada tejido, de aproximadamente 20 mg cada una, en tubos de microcentrífuga de poliestireno de 1,5 ml y tubos de etiqueta. Posteriormente, estas muestras se denominarán muestras desconocidas. Registre la masa exacta de cada muestra, ya que esta información será necesaria para calcular el % de proteína soluble en cada muestra desconocida. Utilice tubos de microcentrífuga con tapas de bloqueo, ya que las tapas que no bloquean pueden abrirse durante el paso de calentamiento posterior, lo que resulta en la pérdida de la solución de muestra.
2. Solubilizar y aislar proteínas de muestra desconocidas
   1. Con una micropipeta, añada 500 μL de NaOH 0,1 M a cada tubo. Cierre bien los párpados y sonique durante 30 minutos. Precalentar un baño de agua caliente a 90 °C.
      PRECAUCIÓN: El hidróxido de sodio es una base fuerte y puede causar quemaduras cuando entra en contacto con la piel. Aunque 0,1 M de NaOH representa una concentración baja, use guantes protectores para evitar la irritación de la piel.
   2. Coloque los tubos en una rejilla en el baño de agua caliente durante 15 minutos.
   3. Centrifugar los tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Pipetear el líquido sobrenadante en nuevos tubos de microcentrífuga marcados, utilizando una nueva punta de pipeta para cada muestra. Añadir 300 μL de NaOH 0,1 M al tubo que contiene el pellet y volver a centrifugar a 15.000 x g durante 10 minutos. De nuevo, recoja el líquido sobrenadante y combínelo con el otro fluido sobrenadante de la misma muestra. Este es un punto de parada potencial, y las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante la noche si es necesario.
3. Precipitar proteínas vegetales
   1. Neutralice el pH de la solución sobrenadante añadiendo 11 μL de HCl 5,8 M. Confirme un pH de ~7 sumergiendo papel tornasol en cada solución de muestra.
      PRECAUCIÓN: El ácido clorhídrico es un ácido corrosivo fuerte que puede causar quemaduras cuando entra en contacto con la piel (aplicación en la piel o inhalación). Use guantes para evitar la irritación de la piel al manipular HCl.
   2. Agregue 90 μL de ácido tricloroacético (TCA) al 100% a cada tubo e incube los tubos en hielo durante 30 minutos. La precipitación de proteínas hará que la solución pase de transparente a opaca. Si esto no ocurre después de 30 minutos, refrigere los tubos durante 1 hora. Este es un punto de parada potencial, y las muestras se pueden almacenar a 4 °C durante la noche si es necesario.
      PRECAUCIÓN: El ácido tricloroacético es corrosivo. Use guantes cuando manipule para evitar el contacto con la piel y evitar la inhalación.
   3. Centrifugar las muestras a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante de TCA aspirándolo con una línea de vacío conectada a una punta de micropipeta de vidrio fino (la misma punta se puede utilizar en todas las muestras). No moleste el pellet de proteína evitando una succión pesada y manteniendo una distancia adecuada entre la punta de la pipeta y el pellet.
   4. Lavar rápidamente el pellet con 100 μL de acetona a -20 °C. Este paso elimina cualquier resto de TCA del pellet, lo que puede interferir con el ensayo de Bradford posterior; Sin embargo, la acetona comenzará a disolver la bolita de proteína si se deja en contacto demasiado tiempo, por lo que se debe agregar acetona y luego extraerla rápidamente de la bolita en 5 segundos.
   5. Permita que la acetona se evapore colocando tubos en una campana extractora o refrigerador. A continuación, disuelva el pellet de proteína añadiendo 1 mL de NaOH 0,1 M a cada tubo. La disolución completa del pellet puede requerir varias rondas de calentamiento en un baño de agua caliente, vórtice y sonicación.
      NOTA: Cuanto más tiempo permanezcan los tubos en la campana extractora o en el refrigerador y cuanto más secos se vuelvan los gránulos, más difícil será volver a solubilizarlos. Se sugiere secar el pellet durante 30 minutos y luego verificar la presencia de acetona cada 10-15 minutos hasta que esté claro que la acetona se ha evaporado (no se detectan vapores de acetona).
4. Mezcle soluciones estándar, diluya soluciones de muestras desconocidas y cuantifique el contenido total de proteínas de muestras desconocidas mediante el ensayo de Bradford.
   1. Prepare soluciones estándar de inmunoglobulina G (IgG) bovina de acuerdo con las concentraciones enumeradas en la Tabla 1 (la solución madre liofilizada o IgG se puede mezclar con agua desionizada para lograr cada concentración). Almacene los estándares a 4 °C. En una placa de 96 pocillos, agregue 160 μL de cada solución estándar de IgG por triplicado comenzando en la posición A1 de la placa de pocillos (0 μg/μL en las posiciones A1, A2, A3, 0,0125 μg/μL en las posiciones B1, B2, B3, etc.).
   2. Prepare una solución diluida de NaOH añadiendo 50 μL de NaOH 0,1 M a 950 μL de agua destilada. Como control negativo en blanco, agregue 60 μL de esta solución a la placa de pocillos por triplicado (posiciones G1, G2, G3).
   3. Prepare diluciones de muestras desconocidas añadiendo 50 μL de cada solución de muestra a 950 μL de agua destilada en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. A continuación, añada 60 μL de cada muestra diluida a la placa del pocillo por triplicado, empezando por la posición H1. Una placa de 96 pocillos debe permitir el análisis de 6 estándares, 1 en blanco y 25 muestras desconocidas cuando se lee por triplicado. Cada placa de pocillo analizada debe contener su propio patrón de IgG y muestras en blanco.
   4. Agregue 100 μL de agua destilada a todos los pocillos de muestras en blanco y desconocidos. Ahora cada pocillo debe contener un total de 160 μL. Usando una pipeta multicanal (8 canales), agregue 40 μL de colorante proteico azul brillante G-250 de Coomassie a cada pocillo en la primera columna de la placa de pocillos. Mezcla el tinte con las muestras sumergiéndolo varias veces. Repita para todas las demás columnas, reemplazando las puntas de pipeta para evitar la contaminación.
      PRECAUCIÓN: Coomassie azul brillante G-250 es irritante y debe evitarse el contacto con la piel, los ojos o los pulmones. Use guantes para evitar el contacto con la piel. Si se produce contacto con la piel, este producto manchará.
   5. Utilice una aguja para reventar las burbujas presentes en los pocillos, ya que pueden interferir con la lectura del espectrofotómetro de microplacas. Limpie la aguja para evitar la contaminación entre pocillos. Deje que la microplaca se incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   6. Utilizando un espectrofotómetro de microplacas, registre los valores de absorbancia de cada pocillo a 595 nm.

Tabla 1. Cálculos de curvas estándar para el ensayo de proteínas solubles.La cantidad de proteína en cada patrón se calcula tomando la concentración de cada patrón y multiplicándola por la cantidad de solución patrón en cada pocillo (160 μL).