Ensayo colorimétrico para la cuantificación de hidratos de carbono no estructurales en tejidos vegetales

1. Recolección y procesamiento de plantas

1. Después de recoger muestras de plantas, congele rápidamente las muestras sumergiendo el material vegetal en nitrógeno líquido con pinzas y guárdelas a -80 °C. Si las muestras de plantas recolectadas son demasiado grandes para congelarlas rápidamente, enfríe rápidamente las muestras con hielo seco y transfiéralas a un congelador de -80 °C lo antes posible. El contenido de macronutrientes del material vegetal puede cambiar después de que los tejidos se separan de la planta, por lo que es importante congelar las muestras de plantas lo antes posible después de la recolección><. cautela: El nitrógeno líquido puede causar congelación severa cuando entra en contacto con la piel. Asegúrese de transportar el nitrógeno líquido en recipientes aprobados y use el EPP adecuado durante su manipulación, incluidos guantes criogénicos, gafas protectoras, protector facial, delantal y una bata de laboratorio.
2. Liofililice el material vegetal con un liofilizador para asegurarse de que los tejidos estén metabólicamente inactivos mientras se elimina el agua. Seque hasta que la masa de la muestra se estabilice para asegurarse de que se haya eliminado toda el agua.
3. Una vez que las muestras estén secas, muela hasta obtener un polvo fino con un molinillo o molino. Almacene las muestras en un gabinete de desecación hasta el análisis.

2. Ensayo de carbohidratos digeribles

1. Preparación de la muestra
   1. Pesar muestras replicadas de cada tejido, de aproximadamente 20 mg cada una, en tubos de vidrio de 15 ml con tapones de rosca revestidos de goma (100 mm de longitud). Posteriormente, estas muestras se denominarán muestras desconocidas. Etiquete los tubos con un marcador impermeable o con cinta adhesiva en las tapas y registre la masa exacta de cada muestra, ya que esta información será necesaria para calcular los %carbohidratos en cada muestra desconocida.
2. Extraiga los carbohidratos digeribles de cada muestra desconocida.
   1. Añada 1 mL de 0,1 M H₂SO₄ a cada tubo y enrosque bien los tapones de los tubos. Coloque en un baño de agua hirviendo durante 1 hora.
      cautela: El ácido sulfúrico es muy corrosivo. Use guantes, gafas y un delantal cuando manipule H₂SO₄, y realice este paso en una campana extractora.
   2. Enfríe los tubos en un baño de agua tibia. Vierta el contenido del tubo en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetados (no se preocupe si queda algo de material vegetal en los tubos de vidrio).
   3. Centrifugar los tubos a 15.000 x g durante 10 minutos. Retire el líquido sobrenadante con una micropipeta y colóquelo en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml etiquetados. En este punto, los tubos se pueden refrigerar durante la noche. Si continúa con el ensayo, consulte el paso 2.3.2.
3. Mezcle soluciones estándar y cuantifique el contenido total de carbohidratos digeribles de muestras desconocidas.
   1. Prepare soluciones patrón de glucosa D(+) con las concentraciones enumeradas en la Tabla 1. Prepare seis tubos de ensayo de vidrio con 400 μL de cada solución estándar.
   2. Pipetear 15 μL de cada muestra desconocida en su propio tubo de ensayo y añadir 385 μL de agua destilada a cada uno para obtener un volumen total de 400 μL en cada tubo de ensayo. En una campana extractora, agregue 400 μL de fenol al 5% a cada tubo de ensayo de muestra estándar y desconocida, y luego pipetee rápidamente 2 mL de H₂SO₄ concentrado en cada tubo. No toque el contenido del tubo de ensayo con la punta de la pipeta, simplemente agréguelo a la superficie de la solución (una pipeta de repetición funciona mejor para esto).
   3. Deje que los tubos se incuben durante 10 minutos y luego vórtelos con cuidado para mezclar el contenido. Incubar durante 30 minutos adicionales.
      cautela: El fenol y el ácido sulfúrico son irritantes corrosivos. Para protegerse de la exposición a la piel, los ojos y la inhalación, este paso debe realizarse en una campana de gases químicos utilizando el EPP adecuado, que incluye: protector facial o gafas protectoras para los ojos, guantes de goma, delantal de laboratorio y botas. La mezcla de fenol con ácido sulfúrico también da lugar a una reacción exotérmica, que hará que los tubos se calienten.
   4. Pipetear 800 μL de muestra de cada tubo en cada una de las 3 cubetas semimicro de poliestireno de 1,5 mL (3 réplicas técnicas por muestra). Configure el espectrofotómetro para que lea a 490 nm. Calibre a una cubeta en blanco que contenga agua destilada antes de leer patrones o muestras desconocidas, y de forma intermitente a lo largo de las lecturas de muestras. Pase cada cubeta a través de un espectrofotómetro y registre la absorbancia. Promedio de las réplicas técnicas para cada muestra desconocida.
      nota: En algunos casos, las muestras pueden superar el umbral superior de absorbancia. Si es así, las muestras deben diluirse en el paso 1.3.1. Las diluciones también deben tenerse en cuenta en los cálculos posteriores.
   5. Calcule la absorbancia media para cada patrón.
      nota: Para calcular la cantidad total de carbohidratos digestibles presentes en cada muestra desconocida utilizando la curva estándar, es más fácil hacer una regresión de la absorbancia promedio de cada patrón contra los microgramos de D(+)glucosa presentes en cada patrón, pero también se puede trazar la concentración de D(+)glucosa (μg/μL) de cada patrón si es deseable. Los siguientes cálculos, sin embargo, se refieren a una curva estándar basada en microgramos, no en concentraciones (μg/μL).
   6. Calcule la curva estándar trazando la absorbancia promedio frente a la cantidad total de D(+)glucosa (μg) en cada solución estándar. Ajuste una línea de regresión lineal a estos datos y, a continuación, utilice la siguiente ecuación para calcular la cantidad total de carbohidratos (μg) en cada muestra desconocida:
      M_c = ((A_x – b)/m)/(15))*1000
      M_c = μg de hidratos de carbono en la muestra
      A_x = absorbancia media de la muestra desconocida
      b = intersección con el eje y (recta de regresión estándar)
      m = pendiente (recta de regresión estándar)
      El coeficiente de correlación de esta línea debe ser mayor que 0,98 y habitualmente cercano a 0,99. Luego, use la siguiente ecuación para determinar el porcentaje de carbohidratos en cada muestra:
      P_c = ((M_c/1000)/(M_i))*100
      P_c =%hidratos de carbono
      M_i = masa inicial de la muestra (mg)

Tabla 1. Cálculo de curva estándar para el ensayo de carbohidratos digeribles. La cantidad de glucosa en cada patrón se calcula tomando la concentración de cada patrón y multiplicándola por la cantidad de solución patrón en cada tubo de ensayo (400 μL)