Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Ensayo de crecimiento de Toxoplasma basado en luciferasa
- Siembra fibroblastos del prepucio humano (HFF) 1 semana antes de la inoculación del parásito para asegurar que las células del huésped sean completamente confluentes. Realice un ensayo simulado en una placa transparente para asegurarse de que los parásitos permanezcan intracelulares durante todo el período de evaluación.
nota: En este caso, el ensayo se lleva a cabo en microplacas de 96 pocillos. De acuerdo con las necesidades experimentales, se puede escalar hasta microplacas de 384 o 1536 pocillos.
- Pase los parásitos Toxoplasma a HFFs confluentes 2 días antes de su uso transfiriendo ~0.3-0.4 mL de parásitos completamente lisados a un matraz T25. Incubar las células huésped infectadas a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 días.
- Jeringa 5 mL de parásitos recién lisados a través de una aguja de seguridad de 21 G 5x para liberar los parásitos intracelulares, luego pase a través de un filtro de 3 μm para eliminar los restos de la célula huésped. Enjuague los parásitos residuales del matraz con 7 ml de medio D10 sin rojo de fenol, luego vuelva a pasar por el filtro.
- Centrifugar los parásitos a 1000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio D10 sin rojo fenol.
- Cuente los parásitos con un hemocitómetro para determinar la concentración.
- Diluya los parásitos a 1 x 104 parásitos/mL para la cepa de tipo salvaje (WT). En el caso de las cepas de parásitos con crecimiento deficiente, aumente la concentración en consecuencia para observar un aumento significativo de las señales de luciferasa.
- Aspire cuidadosamente los medios de 96 microplacas presembradas con HFF e inocule 150 μL de resuspensión de parásitos en pocillos en un formato de tres columnas y cinco filas, lo que representa tres réplicas técnicas y cinco puntos de tiempo.
- Incubar la microplaca a 37 °C y 5% de CO2 durante 4 h.
- Aspire los medios con cuidado de los pocillos para eliminar los parásitos no invadidos, luego llene los pocillos con medios libres de rojo de fenol RT en cada fila (excepto en la primera fila).
- Mezcle volúmenes iguales de PBS y 2 veces tampón de ensayo de luciferasa y diluya el sustrato de luciferasa a 12,5 μM.
- Agregue 100 μL de sustrato de luciferasa diluido en cada pocillo de la fila superior. Incubar las microplacas en RT durante 10 minutos para permitir que las células se lisen completamente.
- Mida la actividad de la luciferasa utilizando un lector de microplacas. Los ajustes del lector de placas se enumeran en la Tabla 1. Cada lectura representa el número inicial de parásitos invadidos a las 4 h después de la infección.
- Repita los pasos 1.9-1.12 para cada fila cada 24 h durante 4 días sin cambiar el medio. Estas lecturas reflejan el número total de parásitos replicados a las 24 h, 48 h, 72 h y 96 h después de la infección.
- Calcule las lecturas promedio en cada punto de tiempo y divídalas por las lecturas promedio a las 4 h para determinar los cambios en el crecimiento del parásito a lo largo del tiempo.
- Trace los datos utilizando software de gráficos.
- Para calcular el tiempo de duplicación, represente los valores log2 de los cambios de pliegue en los puntos de tiempo individuales durante el tiempo de incubación. Utilice una función de regresión lineal para calcular la pendiente, que representa el tiempo de duplicación de cada deformación.
Tabla 1: Ajustes del lector de microplacas para la medición de la actividad de la luciferasa durante el ensayo de crecimiento de Toxoplasma basado en luciferasa
| Luciferase: | Extremo |
| Tiempo de integración: | 1 s |
| Juego de filtros - Emisiones: | A plena luz |
| óptica: | Arriba |
| ganar: | 135 |
| Velocidad de lectura: | normal |
| demorar: | 100 ms |
| Altura de lectura: | 4,5 milímetros |
