Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Evaluación de la eficacia de la inhibición de compuestos químicos contra el crecimiento de Toxoplasma
NOTA: Aquí, se presenta como ejemplo la evaluación de la inhibición de LHVS en el crecimiento de Toxoplasma. Se prueban ocho concentraciones diferentes de LHVS y se realizan tres réplicas técnicas para cada una de las tres réplicas biológicas para las cepas RHΔku80::NLuc y RHΔku80Δcpl::NLuc.
- Antes de la infección por parásitos, se sembraban HFFs en microplacas de 96 pocillos en formato de tres filas y nueve columnas para una réplica biológica por compuesto por cepa. Se permitirá que las células huésped crezcan durante al menos 7 días antes de su uso.
- Defeque los parásitos RHΔku80::NLuc y RHΔku80Δcpl::NLuc durante 2 días antes de su uso.
- Pase los parásitos Toxoplasma a HFFs confluentes 2 días antes de su uso transfiriendo ~0.3-0.4 mL de parásitos completamente lisados a un matraz T25. Incubar las células huésped infectadas a 37 °C con 5% de CO2 durante 2 días.
- Jeringa 5 mL de parásitos recién lisados a través de una aguja de seguridad de 21 G 5x para liberar los parásitos intracelulares, luego pase a través de un filtro de 3 μm para eliminar los restos de la célula huésped. Enjuague los parásitos residuales del matraz con 7 ml de medio D10 sin rojo de fenol, luego vuelva a pasar por el filtro.
- Centrifugar los parásitos a 1000 x g durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio D10 sin rojo fenol.
- Cuente los parásitos con un hemocitómetro para determinar la concentración.
- Diluya los parásitos a 1 x 104 parásitos/mL para la cepa de tipo salvaje (WT). En el caso de las cepas de parásitos con crecimiento deficiente, aumente la concentración en consecuencia para observar un aumento significativo de las señales de luciferasa.
- Resuspenda los parásitos en medios libres de rojo de fenol a 1 x 104 parásitos/mL.
- Aspire los medios de una placa que contenga HFFs confluentes e inocule cada pocillo con 150 μL de resuspensión de parásitos. Incubar la microplaca a 37 °C y 5% de CO2 durante 4 h.
- Prepare LHVS a ocho concentraciones diferentes en un depósito de 12 pozos por dilución en serie. Generalmente, las concentraciones se triplican en forma de dilución en serie.
nota: La concentración más baja se reduce 6.561 veces en relación con la concentración más alta. El cambio de pliegue de la dilución se puede ajustar en consecuencia en función de las diferentes propiedades de los compuestos individuales.
- A las 4 h después de la infección, aspire el medio para eliminar los parásitos no invadidos y llene cada pocillo de las columnas 2-9 con 150 μL de medio suplementado con LHVS a diferentes concentraciones. Deje la primera columna llena con medio regular para que sirva como control no tratado.
- Incubar la microplaca a 37 °C y 5% de CO2 durante 96 h adicionales.
- Aspire los medios con cuidado de los pocillos para eliminar los parásitos no invadidos, luego llene los pocillos con medios libres de rojo de fenol RT en cada fila (excepto en la primera fila).
- Mezcle volúmenes iguales de PBS y 2 veces tampón de ensayo de luciferasa y diluya el sustrato de luciferasa a 12,5 μM.
- Agregue 100 μL de sustrato de luciferasa diluido en cada pocillo de la fila superior. Incubar las microplacas en RT durante 10 minutos para permitir que las células se lisen completamente.
- Medir la actividad de la luciferasa de pozos individuales.
- Promedie las actividades de luciferasa de tres réplicas técnicas de pozos de cada concentración individual de LHVS.
- Divida la actividad promedio de la luciferasa para cada concentración de LHVS por la actividad promedio de la luciferasa derivada de parásitos no tratados para calcular la actividad de la luciferasa normalizada como un porcentaje.
- Grafique las actividades de luciferasa normalizadas frente a las concentraciones individuales de LHVS utilizando un software de gráficos (Figura 1). La inhibición de la pirimetamina contra el crecimiento del parásito también se mide como control. La pirimetamina es un antibiótico clínico utilizado para tratar la toxoplasmosis aguda mediante la inhibición del metabolismo del ácido fólico en Toxoplasma.
- Calcule los valores de IC50 para compuestos individuales utilizando el método incorporado en el software de graficación, respuesta normalizada vs. [inhibidor], bajo el programa de regresión "dosis-respuesta-inhibición". El IC50 se calcula utilizando la siguiente fórmula:
Y = 100/(1 + X/IC50)
Donde: Y representa las actividades normalizadas de luciferasa de las células infectadas bajo diferentes concentraciones de inhibidor, y X representa las concentraciones individuales de inhibidor.
