1. Preparación de liposomas
- Combine las reservas de cloroformo de lípidos en proporciones apropiadas para imitar la membrana mitocondrial externa.
- Prepara 25 mg de mezcla lipídica. Utilizamos una mezcla de lípidos previamente establecida que imita las membranas mitocondriales, que consiste en una proporción molar de 48:28:10:10:4 de fosfatidilcolina (PC) de huevo de gallina, fosfatidiletaminamina de huevo de gallina (PE), fosfatidilinoinotol (PI) de hígado bovino, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina sintética (DOPS) y 1',3'-bis[1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol (TOCL). En la Tabla 1 se muestran ejemplos de cálculos.
- Lleve todas las existencias de lípidos a temperatura ambiente antes de abrirlas, ya que esto limitará la condensación. Como la mayoría de los laboratorios no tienen una forma precisa de medir la concentración de los lípidos, cualquier agua absorbida por el stock de cloroformo cambiará la concentración del stock de lípidos y, por lo tanto, la proporción de lípidos utilizada en el ensayo.
- Como las reservas de lípidos vienen en ampollas de vidrio, transfiera la cantidad requerida de lípidos a un vial de vidrio con una jeringa de 1 mL. Añadir 2 mg de ditiotreitol (DTT) al vial para prevenir la oxidación de los lípidos. Trabaje rápidamente ya que la evaporación del cloroformo cambiará la concentración del lípido.
- Transfiera los lípidos restantes a un vial de vidrio separado y colóquelo con un tabique PFTE. Añadir 2 mg de DTT al vial, envolver con parafilm y almacenar a -20 °C para evitar la oxidación de lípidos. Trate de usar los lípidos dentro de los 3 meses posteriores a la transferencia a los viales. Para evitar la posible contaminación de las existencias de cloroformo por la escorrentía de los marcadores, transfiera las pegatinas de las ampollas originales a los viales de vidrio en lugar de etiquetarlas con marcadores.
- Evapore el cloroformo bajo un chorro muy suave de nitrógeno mientras hace girar el vial de vidrio continuamente a mano en una campana extractora, que actúa esencialmente como un rotovap manual. Gire el vial a una velocidad constante (20-40 rpm) con la mano para mantener los lípidos en movimiento. El objetivo es evaporar todo el cloroformo y obtener una capa uniforme de lípidos en todo el vial de vidrio.
cautela: El cloroformo es neurotóxico y este paso debe realizarse en la campana extractora.
- Coloque una pipeta Pasteur nueva en el tubo de nitrógeno. No permita que ninguno de los lípidos salpique fuera del vial o sobre la pipeta Pasteur. Apunte la punta hacia el fondo del vial para que el aire rebote en el fondo y empuje los lípidos hacia el centro del vial. Obtenga un recubrimiento uniforme en todo el vial evitando cualquier acumulación en las esquinas o por el tapón. Todo este proceso dura unos 5 minutos.
- A medida que la mezcla se espesa en una "perla" de lípidos, guíala hacia el centro del vial cambiando el ángulo del vial. Una vez que la perla comience a hacerse más pequeña, suba ligeramente el chorro de nitrógeno para dispersar la perla, asegurándose de que ninguno de los lípidos salga volando del vial.
- Retire cualquier resto de cloroformo al vacío.
- Coloque el vial de vidrio en una aspiradora doméstica o en una bomba de vacío de diafragma durante 1 hora para eliminar la mayor parte del cloroformo residual. Estas aspiradoras generalmente no son lo suficientemente fuertes como para eliminar todo el cloroformo, pero pueden tolerar pequeñas cantidades de solvente mejor que las aspiradoras de vano rotativo.
- Coloque el vial en un vacío fuerte (<1 mTorr) durante 12-16 h para eliminar todo el cloroformo residual. Asegúrese de evitar golpear el vial durante este proceso.
- Vuelva a suspender los lípidos en 1,25 mL de tampón liposoma (50 mM HEPES KOH pH 7,5, 15% glicerol, 1 mM DTT). Como comenzamos con 25 mg de lípidos, esto da como resultado una concentración de 20 mg/mL. Vuelva a suspender completamente los lípidos sin trozos visibles. Si los lípidos se acumulan en la esquina del vial, este puede ser un proceso largo.
- Agite el vial vigorosamente hasta que la muestra esté suave como la leche. Encontramos que si la evaporación del cloroformo se realizó correctamente la noche anterior, este proceso tarda entre 5 y 10 minutos.
- Para asegurar la resuspensión completa de los lípidos, gire sobre una rueda a temperatura ambiente durante 3 horas a ~ 80 rpm. Retire el vial de la rueda una vez cada hora durante 1 minuto de vórtice para garantizar una mezcla uniforme.
- Transfiera los lípidos con cuidado a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Realice 5 ciclos de congelación-descongelación utilizando nitrógeno líquido para congelar y un bloque de calor a 30 °C para descongelar. Este paso ayuda a convertir las vesículas multilaminares en vesículas unilamelares.
- Extruye los lípidos.
- Durante los ciclos de congelación-descongelación, prepare la miniextrusora. Montar el miniextrusor con soportes de filtro de 10 mm y una membrana de policarbonato del tamaño de poro deseado (nosotros utilizamos 200 nm). El tamaño del filtro afectará el tamaño del liposoma, lo que afectará la concentración de proteínas requeridas para la reconstitución (Paso 2.3).
- Coloque el miniextrusor en una placa calefactora y lleve la temperatura del extrusor a 60 °C.
- Extraiga los lípidos en una jeringa de vidrio hermética al gas de 1 ml y colóquela con cuidado en un extremo de la miniextrusora. Coloque la jeringa hermética al gas vacía en el otro lado de la miniextrusora. Deje que los lípidos se equilibren a la temperatura del soporte de la extrusora durante 5-10 minutos.
- Transfiera los lípidos a la jeringa alternativa empujando suavemente el émbolo de la jeringa llena. Empuje la solución de la jeringa alternativa a la jeringa original. Repita este proceso de ida y vuelta 15 veces, de modo que en el15º paso los lípidos terminen en la jeringa alternativa. Controle el volumen en cada pasada para asegurarse de que no haya fugas.
- Prepare alícuotas de un solo uso de los lípidos, congele rápidamente en nitrógeno líquido y almacene a -80 °C. Los liposomas son estables a -80 °C durante varios meses. Las reconstituciones requieren 10 μL de liposomas a la vez (Paso 2.3.4), por lo que es conveniente preparar alícuotas de 10 μL o 20 μL.
2. Reconstitución de la proteína Msp1 y modelo TA
- Prepare el tampón de reconstitución: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM acetato de potasio, 7 mM de acetato de magnesio, 2 mM de DTT, 10% de sacarosa, 0,01% azida de sodio, 0,2-0,8% Deoxy Big Chaps (DBC).
- Optimice las condiciones de reconstitución para el nuevo lote de liposomas. La concentración de DBC y bioperlas necesarias para una reconstitución óptima varía en función del lote de liposomas utilizados. Para limitar la variabilidad de una preparación a otra, utilice el mismo lote de DBC para todos los experimentos. Al cambiar lotes de DBC, repita el proceso de optimización.
- Establezca una serie de reconstituciones con diferentes concentraciones de DBC (0,2% - 0,8%) y bioperlas (25 mg - 100 mg) cada vez que se prepare un nuevo lote de liposomas. Es importante no dejar caer el DBC por debajo de la concentración crítica de micelas (CMC) de ~0,12%. Una vez que se optimizan las condiciones, recomendamos recopilar todos los datos utilizando las mismas condiciones de preparación y reconstitución de liposomas.
- Evalúe la eficacia de las diversas condiciones de reconstitución utilizando el ensayo de extracción descrito en el paso 3.
- Prepare bioperlas a una concentración final de 250 mg/mL.
- Pese 2,7 g de bioperlas secas y vuelva a suspenderlas en un tubo de centrífuga de 50 ml de metanol al 100 % (unos 45 ml) para humedecer las perlas. Inicialmente, humedezca las bioperlas en metanol para evitar que el aire quede atrapado en los poros de las perlas. Una vez en metanol, mantenga las bioperlas húmedas, ya que cualquier aire atrapado por las bioperlas alterará su capacidad para absorber el detergente.
- Elimine el metanol lavando las perlas 8 veces con aproximadamente 45 mL de agua ultrapura (18,2 mΩ), en lo sucesivo denominadas ddH2O. Perlas de pellets girando a 3.200 x g durante 1 minuto. Decantar el líquido y volver a suspender en ddH2O.
- Después del lavado, volver a suspender en 10 ml de ddH2O con azida sódica al 0,02% y almacenar a 4 °C. Las bioperlas pueden almacenarse a 4 °C durante varios meses. Este stock es de 250 mg/mL, ya que se supone que se pierden ~0,2 g durante los pasos de lavado.
- Calcule el tamaño del liposoma y el número deseado de moléculas de proteína TA y Msp1 por liposoma. Esto determinará la concentración de Msp1 y TA necesaria para la reconstitución.
- En primer lugar, calcule el número de moléculas lipídicas por liposoma unilaminar (Ntotal) utilizando la ecuación
donde d es el diámetro del liposoma, h es el espesor de la bicapa y a es el área del grupo principal de lípidos.
- Mida el diámetro del liposoma mediante DLS. En nuestro ejemplo, se obtuvo un valor de 70 nm para el diámetro del liposoma (d).
- Utilice un valor de 5 nm para h y 0,71 nm2 para a, que es el tamaño del grupo principal para la fosfatidilcolina. En esta situación particular, eltotal de N es 37.610.
- A continuación, calcule la concentración molar de lípido MLipid utilizando el peso molecular medio de los lípidos de la mezcla. En este ejemplo, la concentración de lípidos es de 20 mg/mL (Paso 1.4) y el peso molecular medio de los lípidos es de 810 g/mol (Tabla 1). Esto da como resultado un valor de 0,0247 M para ellípido M.
- A continuación, calcule la concentración molar de liposomas, M Liposome, utilizando la ecuación
donde M Lipid es la concentración molar de lípidos del Paso 2.3.2, y Ntotal es el número total de lípidos por liposoma calculado en el Paso 2.3.1. En este ejemplo, la concentración de 20 mg/mL de liposomas es de aproximadamente 660 nM.
- Calcule la cantidad de proteína Msp1 y TA necesaria para una reacción de reconstitución de 100 μL.
nota: La concentración final de lípidos en la reconstitución es de 2 mg/mL, que es una dilución 10 veces mayor del caldo de liposomas. Esto da una concentración final de liposomas de 66 nM. La concentración final de Msp1 es de 792 nM, lo que da un promedio de 12 copias totales (2 hexámeros funcionales) por liposoma. La concentración final de la proteína TA es de 660 nM, lo que da un promedio de 10 copias por liposoma.
- En un tubo de PCR, mezcle Msp1 purificado, proteína TA y liposomas en tampón de reconstitución. El orden de adición es el tampón, las proteínas y los liposomas al final. El volumen total es de 100 μL. Deje reposar la mezcla sobre hielo durante 10 minutos. Purifica la proteína Msp1 y TA.
- Utilice la proteína TA modelo bien caracterizada His-Flag-Sumo-Sec22 como sustrato de control positivo cuando establezca el ensayo por primera vez. Esta construcción tiene una etiqueta His para una fácil purificación, una etiqueta 3x-Flag para la detección por Western blot, un dominio Sumo para aumentar la solubilidad y el TMD de la proteína ER-TA Sec22 para la reconstitución y el reconocimiento por Msp1.
- Asegúrese de que las soluciones madre de Msp1 y la proteína TA sean de aproximadamente 100 μM para minimizar el efecto de N-Dodecil β-D-maltósido (DDM) de la purificación de la proteína en la reconstitución. La Msp1 purificada se encuentra en 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM de cloruro de sodio, 0.1 mM de clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 0.05% DDM, mientras que la proteína TA purificada está en 50 mM Tris pH 7.4, 150 mM de cloruro de sodio, 10 mM de cloruro de magnesio, 5 mM de β-mercaptoetanol, 10% glicerol, 0.1% DDM. Las soluciones madre de aproximadamente 100 μM de proteína TA y monómero Msp1 aseguran que estos componentes constituirán < 5% del volumen final de reconstitución, lo que resulta en una dilución de DDM por debajo del CMC.
- Agregue la cantidad deseada de bioperlas a la muestra para eliminar el detergente.
- Corte la punta de una pipeta p200 de aproximadamente 1/8 de pulgada de diámetro para que las perlas puedan caber a través de la punta. Agite el tubo de bioperlas a fondo para obtener una mezcla uniforme y retire rápidamente la tapa y la pipetea el volumen antes de que las bioperlas se asienten. Transfiera las bioperlas a un tubo de PCR vacío.
- Cuando la reconstitución haya terminado su incubación de 10 minutos en hielo, utilice una punta de pipeta sin cortar para eliminar todo el líquido de las bioperlas. A continuación, transfiera la reconstitución de 100 μL al tubo con las bioperlas. Esto debe hacerse rápidamente para que las bioperlas no atrapen el aire, lo que hará que las perlas floten.
- Deje que la reconstitución gire sobre una rueda a ~ 80 rpm durante 16 horas a 4 °C.
- Retire el material reconstituido de las bioperlas. Haga un giro rápido en un picofuge para granular las bioperlas y luego use una punta de pipeta sin cortar para transferir el material reconstituido a un tubo de PCR limpio. Repita este proceso 1-2 veces hasta que no queden bioperlas en la muestra. Mantenga la reconstitución en hielo.
- Limpie previamente el material reconstituido para eliminar cualquier proteína que no haya podido reconstituirse en los liposomas.
- Tampón de extracción: 50 mM HEPES pH 7,5, 200 mM acetato de potasio, 7 mM acetato de magnesio, 2 mM DTT, 100 mM de cloruro de calcio.
- Equilibre las columnas de centrifugado de glutatión con el tampón de extracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por lo general, esto implica 3 rondas de lavado con 400 μL de tampón y luego centrifugar a 700 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente para eliminar el tampón.
- Agregue 5 μM de cada chaperona (GST-SGTA y GST-Calmodulin) al material reconstituido. Estas chaperonas se unirán a la TMD de cualquier proteína que no haya podido reconstituirse en los liposomas. La purificación de las chaperonas se describió anteriormente.
nota: Estos acompañantes están disponibles comercialmente, pero preferimos purificarlos internamente para controlar el costo y la calidad. Ambas proteínas se encuentran en Tris pH 7,5 de 20 mM, cloruro de sodio de 100 mM y TCEP de 0,1 mM, y tienen una concentración de stock de alrededor de 160 μM. SGTA reconoce sustratos con una TMD altamente hidrofóbica, mientras que la calmodulina se une a TMD con hidrofobicidad moderada. En conjunto, este cóctel de acompañantes puede reconocer una amplia gama de sustratos.
- Añada 100 μL de tampón de extracción al material reconstituido, elevando el volumen hasta 200 μL. Añada esto a las columnas de centrifugado de glutatión equilibradas. Tenga en cuenta que las columnas de centrifugado de glutatión proporcionan la mayor recuperación de muestras cuando el volumen de preaclarado es de 200 a 400 μL.
- Tape las columnas de centrifugado y gírelas a ~ 80 rpm a 4 °C durante 30 minutos para permitir que las chaperonas se unan a la resina.
- Girar las columnas a 700 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente. El flujo a través es material previamente aclarado que se agota de proteínas agregadas. Mantenga el material en hielo y proceda directamente con el ensayo de extracción.
3. Ensayo de extracción
- Prepare los tubos para el análisis SDS PAGE. Cada reacción tendrá 4 tubos: ENTRADA (I), FLUJO A TRAVÉS (FT), LAVADO (W) y ELUTO (E).
- Agregue 45 μL de muestra de ddH2O al tubo de entrada, 40 μL de ddH2O al tubo FLOW THROUGH y 0 μL a los tubos WASH y ELUTE.
nota: La mejor relación señal-ruido en este ensayo se obtiene cuando las muestras WASH y ELUTE están 5 veces concentradas en relación con las muestras INPUT y FLOW THROUGH. Debido a las diluciones durante el ensayo, esto requiere tomar 5 μL de muestra para la muestra INPUT, 10 μL de muestra para la muestra FLOW THROUGH y 50 μL de muestra para las muestras WASH y ELUTE.
- Agregue 16.6 μL de 4x SDS PAGE Loading Buffer a cada tubo. El volumen total de cada muestra es de 50 μL antes del búfer de carga de SDS PAGE. El volumen final es de 66,6 μL (50 μL de muestra + 16,6 μL de 4x SDS PAGE Loading Buffer).
- Ensamble el ensayo de extracción.
- Prepare la reacción de extracción que contenga 60 μL de proteoliposomas previamente aclarados, 5 μM de GST-SGTA, 5 μM de GST-Calmodulina y 2 mM de ATP. Combine todos los reactivos excepto el ATP, que se utiliza para iniciar la reacción. Llevar a un volumen final de 200 μL con tampón de extracción.
nota: Dado que se utilizan 60 μL de muestra para cada ensayo de extracción, se puede utilizar una reconstitución para tres ensayos de extracción diferentes. Realizar controles positivos y negativos (+ATP y -ATP) sobre material de la misma reconstitución.
- Ensayo de extracción precalentado en bloque térmico a 30 °C durante 2 minutos.
- Inicie el ensayo de extracción añadiendo ATP a la concentración final de 2 mM y temporizador de inicio.
- Dé una vuelta de 5 segundos en un picofuge para mezclar el ATP en la reacción. Reacción de incubación a 30 °C durante 30 minutos.
- Durante la incubación, tome 5 μL de la reacción y añádalos al tubo INPUT. El momento de esto es flexible.
- Durante este período de incubación, equilibre una columna de centrifugado de glutatión para cada muestra en el ensayo de extracción.
- Realice el pull-down en las chaperonas para aislar el material extraído.
- Una vez finalizada la incubación de 30 minutos, añadir 200 μl de tampón de extracción al tubo para llevar el volumen total a 400 μL. Añadir a la resina de glutatión equilibrada y dejar que se adhiera en la rueda a 4° C durante 30 minutos.
- Gire las columnas a 700 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente para recoger el flujo. Tome 10 μL para el tubo FLOW THROUGH. Esta muestra contiene sustratos que todavía están integrados en la bicapa lipídica.
- Lave la resina dos veces con 400 μL de tampón de extracción, desechando el flujo a través. En el tercer lavado, mantenga el flujo y tome 50 μL para el tubo de lavado.
- Prepare 5 mL de tampón de elución agregando glutatión reducido a una concentración final de 5 mM en tampón de extracción. Prepare este tampón fresco cada vez.
- Añada 200 μL de tampón de elución a la columna de centrifugación. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Girar a 700 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente para eluir. Mantén el flujo. Repita el proceso una segunda vez para que el volumen total de elución sea de 400 μL.
- Tome 50 μL de muestra de la muestra de elución y añádala al tubo de elución.
| lípido | Mole % | Mw | Promedio de MW | μmol en 25 mg | mg en 25 mg | Stock de cloro (mg/mL) | μL por 25 mg |
| PC | 48% | 770 | 369.6 | 14.82 | 11.41 | 25 | 456.4 |
| pei | 28% | 746 | 208.88 | 8.64 | 6.45 | 25 | 258.0 |
| pi | 10% | 902 | Artículo 90.2 | 3.09 | 2.78 | 10 | 278.5 |
| DOPS | 10% | Artículo 810 | 81 | 3.09 | 2.50 | 10 | Artículo 250.1 |
| TOCL | 4% | Año 1502 | 60.08 | 1.23 | 1.85 | 25 | Artículo 74.2 |
| Conc. Corr Promedio MW | 809.76 |
| μmol en 25 mg | 30.87 |
Tabla 1: Cálculos de muestras para la preparación de liposomas. Los objetivos clave de esta tabla son calcular la concentración corregida del peso molecular medio de la mezcla de lípidos y el volumen de cada stock lipídico necesario para producir los liposomas. El MW y la concentración de existencias provienen de las etiquetas de los productos. Los lípidos y el % molar son elegidos por el usuario.
