1. Ensayo de β-galactosidasa
NOTA: La cuantificación de la actividad de la β-galactosidasa se utiliza como una forma indirecta de determinar el número de parásitos. Se espera que el crecimiento se inhiba en presencia de un compuesto tripanocida, lo que conduce a un menor número de parásitos en comparación con el control no tratado, lo que se reflejará en una menor actividad de β-galactosidasa y, por lo tanto, una menor absorbancia.
- Incubar los parásitos con BZN
- Agregue 100 μL de la solución correspondiente de 2x benznidazol (BZN) por pocillo para alcanzar una concentración final de BZN de 80, 40, 20, 10, 5 y 2,5 μM a 100 μL de suspensión de epimastigote, células Vero con amastigotes (2 días después de la infección) o tripomastigotes en una placa de 96 pocillos.
- Incubar los epimastigotes a 28 °C durante 72 h, y los tripomastigotes o células Vero infectadas con amastigotes durante 24 h a 37 °C y 5% CO₂.
nota: Cada concentración de fármaco debe evaluarse al menos por triplicado e incluir cultivos de control de epimastigotes, tripomastigotes y células Vero infectadas con dimetilsulfóxido (DMSO).
- Reacción colorimétrica
- Después del período de incubación del tratamiento, si las células Vero infectadas o los tripomastigotes están en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco con rojo fenol, reemplace el medio con 100 μL de PBS 1x para evitar interferencias. Realice pocillos en blanco por triplicado que contengan solo 100 μL del medio correspondiente (o 1x PBS según corresponda).
nota: No es necesario retirar el medio de cultivo para epimastigotes en el caso de medio LIT o DMEM sin rojo fenol. Todavía se puede usar DMEM con rojo de fenol; prepare un pozo en blanco con DMEM solo para medir la absorbancia base y luego reste este valor durante el análisis de datos. El medio para insectos de Schneider, que es incoloro, es una alternativa para los epimastigotes.
- Añadir 40 μL de solución de sustrato de rojo de clorofenol β-D-galactopiranósido (CPRG) y 10 μL de la solución de detergente a cada pocillo, obteniendo una concentración final de 200 μM de CPRG y 0,1% de detergente en un volumen final de 250 μL en cada pocillo
nota: La solución de CPRG y el detergente se pueden agregar en un volumen final de 50 μL por pocillo.
- Incubar a 37 °C durante 2 h y medir la absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
nota: El cambio de color esperado es de amarillo a marrón rojizo en la escisión enzimática de la β-galactosidasa (Figura 1A). El tiempo de incubación se puede extender hasta 4 h, y los espectros de absorbancia del rojo de clorofenol se pueden leer entre 570 y 595 nm con un ajuste de curva similar. La incubación de hasta 24 h en presencia de sustrato CPRG ha mostrado ajustes de curva similares.
