Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Liberación de monoamina endógena ex vivo a partir de cortes de cerebro o punzones
NOTA: El dispositivo utilizado para esta sección consta de una placa de 48 pocillos y un soporte de pañuelo hecho de seis unidades de filtro de microcentrífuga sin los filtros insertados conectados a una línea de carbógeno (Figura 1). Para hacer el soporte, use una varilla de plástico resistente (por ejemplo, de un raspador de celdas) y pegue las unidades de filtro de microcentrífuga sin los filtros insertados. Déjalo secar durante 1-2 días. El tiempo requerido para el experimento de liberación de monoamina endógena y las concentraciones de anfetamina, fluoxetina y cocaína se basan en la literatura actual y los protocolos previos.
- Activación tisular
- Transfiera el tejido cerebral a cada pocillo de la cámara de eflujo y permita la recuperación durante 30-50 min a 37 °C en un calentador de portaobjetos en 0,5-1 mL de tampón de eflujo oxigenado, con burbujeo constante y suave (Figura 1B1).
- Durante esta incubación, diluya los fármacos hasta la concentración deseada para el experimento. Todos los fármacos deben disolverse en tampón de eflujo, y las concentraciones se basan en la literatura actual.
- Primera incubación
- Mueva el soporte de tejido con tejido cerebral a pocillos que contengan 500 μL de tampón de eflujo oxigenado e incube durante 20 min a 37 °C. Asegúrese de que se transporta un tampón mínimo o nulo golpeando el soporte en el borde del pocillo hasta que no haya exceso de tampón en el soporte.
- En experimentos con agentes farmacológicos como los inhibidores del transportador de monoaminas, se incuban las muestras de tejido con los fármacos diluidos en tampón de eflujo oxigenado (por ejemplo, 10 μM de fluoxetina, 40 μM de cocaína; véase la figura 1B2). El volumen final de cada pocillo será de 500 μL.
- Segunda incubación
- Mueva el soporte con el tejido a un nuevo conjunto de pocillos que contenga 500 μL de tampón de eflujo total con o sin la concentración deseada de cada fármaco. Asegúrese de que no quede ningún exceso de búfer. Cada pozo representa un n= 1 para las condiciones experimentales. Cada condición experimental se realiza por triplicado.
- Un pocillo incluye un tampón de eflujo oxigenado, el siguiente 10-30 μM de AMPH y el último pocillo incluye 10-30 μM de AMPH más inhibidores del transportador de monoaminas. Cada fármaco se disuelve en un tampón de eflujo oxigenado.
- Incubar el tejido durante 20 min a 37 °C con 500 μL de la condición del medicamento.
nota: Los pozos adicionales pueden incluir un tampón oxigenado de alto eflujo de K+ con o sin los inhibidores del transportador de monoaminas. Disuelva cada fármaco en el tampón de eflujo oxigenado (500 μL).
- Durante esta segunda incubación de 20 min, recoja la solución de los pocillos de la primera incubación en el paso 1.2.1 y transfiérala a tubos de microcentrífuga que contengan 50 μL de ácido perclórico 1 N o ácido fosfórico (dependiendo del tipo de HPLC, concentración final 0,1 N). El volumen final de la muestra será de 550 μL. Mantenga los tubos de microcentrífuga en hielo y etiquete los tubos # 1.
- Después de la segunda incubación de 20 min, mueva el soporte de pañuelos con secciones de cerebro o punzones a un pozo vacío y mantenga la placa en hielo. Transfiera el sobrenadante a tubos de microcentrífuga que contengan 50 μL de ácido perclórico 1 N o ácido fosfórico. El volumen final de la muestra será de 550 μL. Mantenga los tubos de microcentrífuga en hielo y etiquete los tubos # 2.
- Agregue 1 mL de tampón de disección helado a cada pocillo que contenga tejido. Recoja todo el tejido con pinzas pequeñas y transfiéralo a tubos de microcentrífuga limpios.
- Mantenga los tubos con tejido encefálico a -80 °C. Deseche 1 mL de tampón de disección (Figura 1B4).
- Soluciones de filtro obtenidas de cada incubación utilizando tubos de filtro de microcentrífuga (0,22 μm) a 2.500 x g durante 2 min. Utilice el filtrado para determinar el contenido de monoamina utilizando HPLC con detección electroquímica (Figura 1B5).
