Todos los procedimientos con animales descritos aquí han sido aprobados por el comité institucional de uso y núcleo de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai.
1. Preparación antes del aislamiento de las células valvulares de ratones adultos
- Limpie y esterilice todo el instrumental quirúrgico que se muestra en la Figura 1A utilizando etanol al 70% v/v y posteriormente esterilizándolos en autoclave durante 30 min. Limpie el espacio de trabajo quirúrgico con etanol al 70%.
- Añadir 500 μL de penicilina-estreptomicina a 50 mL de HEPES de 10 mm. Prepare una alícuota de 50 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mantén las soluciones en hielo.
- Prepare soluciones de colagenasa de 1 mg/mL y 4,5 mg/mL y use 5 mL de cada solución en tubos de 15 mL para realizar todo el procedimiento. Para preparar 5 mL de colagenasa de 1 mg/mL, mezcle 5 mg de colagenasa con 2,5 mL de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, libre de suero fetal bovino (FBS)) y 2,5 mL de HEPES de 10 mM suplementado con antibióticos (1% de penicilina-estreptomicina del paso 1.2). Filtre las soluciones a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar cualquier contaminación.
NOTA: Mantenga las soluciones en hielo para proteger las enzimas.
- Calentar la solución DMEM a 37 °C antes de usarla en todos los pasos que se describen a continuación. Prepare el medio completo suplementando DMEM con penicilina-estreptomicina al 1%, piruvato de sodio al 1%, 5 mL de L-glutamina de 200 mM, 1 mL de reactivo de eliminación de micoplasmas (consulte la Tabla de materiales) y FBS al 10%.
2. Aislamiento de celdas valvulares
- Para obtener 105 células para el experimento, use cinco ratones de 8 semanas de edad (mínimo de tres). Coloque el ratón en una cámara de inducción junto con un pequeño trozo de papel de seda empapado con 1 mL de isoflurano, pero no permita el contacto con el tejido. Para confirmar que el animal está completamente anestesiado; Verifique el reflejo de pellizco del dedo del pie y luego eutanasiar al ratón por dislocación cervical. Use isoflurano para aliviar cualquier dolor antes de la luxación cervical, ya que el procedimiento descrito a continuación es terminal.
- Coloque el ratón en una plataforma de disección y fije las patas con cánulas para mantenerlo en su lugar. Limpiar el tórax y el abdomen con etanol; Abre el abdomen y el pecho con unas tijeras. Con unas tijeras quirúrgicas pequeñas, corte entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo para desangrar al ratón. Perfunda el corazón con 10 mL de PBS frío 1x para eliminar la sangre del corazón.
- Corte el corazón y manténgalo a 3 mm de la aorta ascendente como se muestra en la Figura 1B. Diseccionar la válvula aórtica con un microscopio estereoscópico. Corte el corazón horizontalmente en el centro de los ventrículos (Figura 1C). Corte el ventrículo izquierdo hacia la aorta y diseccione cuidadosamente la válvula aórtica (Figura 1D-F). Agrupe las válvulas en una pequeña placa de cultivo de tejidos de 35 mm.
- Lavar las válvulas aisladas en una placa de cultivo celular de 75 mm con 5 mL de HEPES frío (10 mM) suplementado con antibióticos (1% de penicilina-estreptomicina) para extraer la sangre (Figura 2). Prepare dos tubos de colagenasa de 15 mL 1 mg/mL y 4,5 mg/mL como se describe anteriormente en el paso 1.3.
nota: Después de la disección, manipule las válvulas aisladas en una campana de bioseguridad estéril para minimizar la contaminación.
Incubar las válvulas en colagenasa tipo I (1 mg/mL) durante 30 min a 37 °C con agitación continua (Figura 2). Centrifugar el tubo durante 5 min a 150 × g, lavar el pellet una vez con 2 mL de HEPES (10 mM) y vórtice durante 30 s a alta velocidad. Vierta el contenido de este tubo en una placa de cultivo de 35 mm y transfiera con cuidado los fragmentos de tejido con pinzas finas a un tubo nuevo.
nota: En esta etapa, las CIC aún no están disociadas del tejido y el pellet contiene trozos de tejido. Para evitar la contaminación con células endoteliales, no centrifugar después del vórtice en el paso 2.5.
- Incubar el pellet en un tubo de 15 mL con 5 mL de colagenasa tipo I (4,5 mg/mL) a 37 °C bajo agitación continua durante 35 min. Vuelva a suspender las células con una pipeta de 1 mL para separar las células y centrifugar a 150 × g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 mL de DMEM completo. Centrifugar a 150 × g durante 5 min a 4 °C. Repita este paso dos veces para limpiar las celdas.
nota: El pellet todavía tendrá algunos fragmentos de tejido.
- Vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo y coloque las células en un pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos en una cantidad mínima de medio para facilitar su fijación a la placa de cultivo. Deje las células, sin tocarlas, en una incubadora a 37 °C con un 5% de dióxido de carbono.
- Después de 3 días, revise las células bajo el microscopio para verificar un buen crecimiento cerca de los restos de tejido. Una vez que 1.000 células sean visibles bajo el microscopio, retire cuidadosamente los restos de tejido con pinzas esterilizadas en autoclave y cambie el medio.
nota: La placa no debe ser alterada; Si no se observa el número requerido de células, vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora durante otros 2 días.
- Cuando las células tengan un 70% de confluentez (2,5 × 105), tripsinícelas y luego transfiérelas a una placa de cultivo de tejidos de 75 mm.
3. Ensayo de calcificación in vitro
- Limpie la campana con etanol al 70%, caliente el medio DMEM a 37 °C.
- Siembrar 100.000 células/condición en placas de 6 pocillos en DMEM completo y cultivar durante 24 h a 37 °C.
- Prepare el medio calcificante mezclando 2 mM de NaH2PO4, 10-7 M de insulina y 50 μg/mL de ácido ascórbico en DMEM con 5% de FBS. Para 93 mL de DMEM, agregue 5 mL de FBS, 1 mL de antibióticos (concentración final 1%), 1 mL de piruvato de sodio (100 mM), 27,5 mg de NaH2PO4, 5,8 μL de insulina y 5 mg de ácido ascórbico.
NOTA: Filtre la solución con un filtro de 0,22 μm antes de usarla.
- Después de 24 h, sustituya el medio sobrenadante por el medio calcificante. Incubar las células durante 7 días a 37 °C. Al 3er día, reemplácela con medio calcificante fresco y vuelva a colocar la placa en la incubadora para completar los 7 días de tratamiento.
- Después de 7 días, retire el medio y lave las células dos veces con 2 mL de 1x PBS. Incubar las células en 1 mL de ácido clorhídrico (HCl) 0,6 N durante 24 h a 37 °C. Recoger el HCl en un tubo de 1,5 mL y evaporarlo en un evaporador rotativo. Vuelva a suspender el contenido de todos los tubos en 60 μL de HCl.
nota: El procedimiento de secado es importante para concentrar la solución y tener el mismo volumen para cada condición.
- Utilice una placa de 96 pocillos para medir la concentración de calcio utilizando el reactivo Arsenazo III, disponible en un kit listo para usar (consulte la Tabla de Materiales para obtener más detalles).
- Prepare una solución estándar de calcio de 10 mg/dL de concentración. Pesar 10 mg de hidróxido de calcio (Ca(OH)2) y disolver en 100 mL de agua destilada.
En una placa transparente de 96 pocillos, pipetee 2 μL de solución en blanco (HCl, 0,6 N), la solución estándar, la muestra por pocillo (10 mg/dL) y las muestras. Realice el experimento por triplicado para verificar la variabilidad del pipeteo. Añadir 200 μL del reactivo para cada condición.
nota: Las muestras por encima de 15 mg/dL deben diluirse 1:1 con solución salina, volver a analizar y el resultado multiplicarse por dos.
- Incubar la reacción durante 15 min a temperatura ambiente.
nota: La reacción es estable durante 60 min.
- Lea y registre la absorbancia de la placa a 650 nm. Utilice la siguiente fórmula para calcular la cantidad de calcio en las muestras:
Calcio (mg/mL) = (Absorbancia de la muestra/absorbancia del patrón) × Concentración del patrón
