Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado animal y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. PM2.5 muestreo y extracción de compuestos orgánicos
NOTA: PM2.5 se recolectó en un área urbana en Suzhou, China, del 1 al 7 de agosto de 2015, como se describió anteriormente.
- Hornee filtros de membrana de cuarzo de 47 mm en un horno de mufla a 500 °C durante 2 h para eliminar los componentes orgánicos.
- Coloque un filtro en un muestreador PM2.5 durante 24 h de muestreo ininterrumpido.
- Retire el filtro y seque durante 24 h a temperatura ambiente.
- Cuantifique el filtro con una balanza analítica.
- Extraiga los componentes orgánicos del filtro mediante extracción Soxhlet utilizando diclorometano como disolvente.
- Seque el EOM mediante evaporación rotativa en un baño de agua a 60 °C y flujo de nitrógeno. Disuelva EOM en DMSO y almacene a -20 °C.
2. Recolección y tratamiento de embriones de pez cebra
- Mantener el pez cebra a 28,5 ± 0,5 °C en un sistema de acuicultura de recirculación con un ciclo de fotoperiodo de 14 h de luz y 10 h de oscuridad.
- Coloque el pez cebra adulto sano en un tanque en una proporción de 2:1 macho a hembra.
- Al día siguiente, recoja los embriones y lávelos con agua del sistema (es decir, agua de reproducción de pez cebra).
- Seleccione y divida aleatoriamente los embriones de pez cebra que muestren un desarrollo normal (tamaño uniforme, granos completos y sin coagulación de huevos) en 4 grupos en placas de Petri de vidrio individuales con un diámetro de 7 cm (aproximadamente 50 embriones por placa).
- Tratar los embriones con PM2.5 (5 mg/L) en presencia o ausencia de NAC a 0.25 μM desde 2 hpf hasta 72 hpf. Utilice el DMSO como control del vehículo hasta una concentración final del 0,1% (v/v).
3. Observación morfológica de embriones de pez cebra y disección cardíaca
- A 72 hpf, transfiera los embriones a portaobjetos de vidrio y observe bajo un microscopio estereoscópico. Registre las malformaciones cardíacas, como edema pericárdico, alteración del bucle y disminución del tamaño.
- Calcule las tasas de malformación (el porcentaje de embriones con defectos cardíacos del total de embriones vivos) y analice las diferencias entre los grupos utilizando el ANOVA de un factor seguido de la prueba de comparación múltiple de Turquía (p < 0,05 = estadísticamente significativo).
- Anestesiar los embriones con 0,6 mg/mL MS-222 para inmovilizarlos en portaobjetos de vidrio.
- Registre los latidos del corazón durante 30 segundos y cuantifique las frecuencias cardíacas con el software ImageJ.
- Disecciona corazones de embriones de pez cebra con una aguja de jeringa desechable bajo un microscopio estereoscópico. Precaución: Evite destruir la forma del corazón.
4. Ensayo de inmunofluorescencia
- Para utilizar un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño inducido por el ADN de PM2.5 en el corazón de embriones de pez cebra, use un bolígrafo de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un lado de vidrio limpio.
- Agregue 50 μL de paraformaldehído al 4% a 1,25 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una solución fijadora.
- Coloque 3 corazones disecados en un círculo de bolígrafo de barrera hidrofóbica e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, de modo que los corazones se adhieran completamente a los portaobjetos de vidrio.
- Lave los portaobjetos tres veces en PBS con 0.1% Tween 20 (PBST) durante 5 minutos por lavado.
- Añadir 50 μL de albúmina sérica bovina (BSA) a 1000 μL de PBST para obtener una solución de BSA al 5% e incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 1 h para bloquear la unión de anticuerpos inespecíficos.
- Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante 5 minutos por lavado.
- Diluir 2 μL de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-OHdG y 2 μL de anticuerpo policlonal de conejo contra γH2AX en 296 μL de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios que funcione.
- Incubar las muestras de corazón con 50 μL de la solución de cóctel de anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX en una cámara humidificada durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (la incubación nocturna puede aumentar la intensidad de la señal).
- Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante 5 minutos por lavado.
- Diluir 1 μL de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y 1 μL de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra cy3 en 498 μL de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos secundarios de trabajo e incubar las muestras con los anticuerpos secundarios (1:500 en PBST) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante 5 min por lavado protegidas de la luz.
- Añadir 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) a las muestras para la tinción nuclear durante 30 min a temperatura ambiente.
- Aplique un cubreobjetos para deslizar y sellar con esmalte de uñas para evitar que se seque y se mueva. A continuación, obtenga imágenes de las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal de fluorescencia del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos con el promedio de las muestras de control de DMSO. Determine la significación estadística de los datos como en el paso 3.2.
