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Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
1. Preparación de cortezas de corteza rinal-hipocampo
NOTA: La preparación de cortezas de corteza rinal-hipocampo utiliza ratas P6-7 Sprague-Dawley.
- Montaje del cultivo y preparación del medio
- El día antes del cultivo, prepare los medios necesarios y colóquelos a 4 °C.
- Preparar el medio de disección: 25 mM de glucosa en la solución salina equilibrada (GBSS) de Gey.
- Medio de cultivo preparado: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Suero de caballo (HS), 25 mM de glucosa, 30 μg/mL de gentamicina.
- Prepare el medio de mantenimiento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/mL de gentamicina, HS (15%, 10%, 5% y 0%).
- Sustracción de cerebros
- Justo antes de iniciar el cultivo, añada 1,1 mL de medio de cultivo a cada pocillo de la placa de 6 pocillos con una pipeta P1000 y colóquelo a 37 °C.
- Coloque todo el equipo (microscopio de disección, picador de tejidos, lámpara de disección, herramientas de disección, electrodos, placas, insertos y papeles de filtro) dentro de la cabina de seguridad biológica y esterilice bajo luz ultravioleta durante 15 minutos.
- Ajuste el grosor de la rebanada a 350 μm.
- Retira el GBSS de la nevera. Agregue 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Se requerirán seis placas de Petri por animal.
- Sacrifica al cachorro de rata. Realizar la decapitación utilizando una tijera afilada en la base del tronco encefálico del animal.
- Lave la cabeza del animal tres veces en GBSS frío y llévela dentro del armario de seguridad.
- Aislamiento de tejidos y preparación de lonchas
- Inserte firmemente pinzas afiladas en las cuencas de los ojos para sujetar la cabeza.
- Con una tijera fina, corte la piel/cuero cabelludo a lo largo de la línea media desde el agujero vertebral hacia los lóbulos frontales y déjelo a un lado.
- Cortar de la misma manera el cráneo y a lo largo de la fisura transversal cerebral (espacio entre el cerebro y el cerebelo). Con pinzas largas curvas, sepárela.
- Deseche los bulbos olfativos con una espátula. Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en un GBSS helado con la superficie dorsal hacia arriba (Figura 1A).
- Inserte las pinzas finas en el cerebelo y recorra la línea media con la espátula abriendo cada hemisferio con mucho cuidado (Figura 1B).
- Con pinzas de curva corta, retire con cuidado el exceso de tejido que cubre el hipocampo, sin tocar la estructura del hipocampo. Luego, con una espátula, corte por debajo de cada hipocampo (Figura 1C).
- Toma un hemisferio y colócalo, con el hipocampo hacia arriba, sobre un papel de filtro. Repite el procedimiento con el otro hemisferio y colócalo paralelo al primero, en el papel de filtro. Coloque el papel de filtro en la picadora de pañuelos, con los hemisferios perpendiculares a la cuchilla, y corte los hemisferios en rodajas de 350 μm (Figura 1D).
- Coloque el tejido en rodajas en una placa de Petri con GBSS frío (Figura 1E).
- Separe cuidadosamente las rodajas con los electrodos de punta redonda (Figura 1F). Conserve solo las rodajas con una corteza rinal y un hipocampo estructuralmente intactos. Las áreas DG y CA deben estar perfectamente definidas, así como la corteza entorrinal y perirrinal (Figura 1G).
- Coloque cada rebanada en el inserto (Figura 1H-I), con una espátula y un electrodo de punta redonda. Retire el exceso de medio de disección alrededor de cada corte con una pipeta P20 (Figura 1J). Se pueden cultivar cuatro cortes de corteza rinal e hipocampo en un solo inserto (Figura 1K).
- Mantenimiento de la cultura
- Cambia el medio cada dos días.
- Calentar el medio a 37 °C.
- Toma las placas de la incubadora. Levante cada inserto sujetando el borde de plástico con pinzas (Figura 1L).
- Use una mano libre para aspirar el medio desde el pozo. Vuelva a colocar el inserto en el pocillo y agregue 1 mL, con una pipeta P1000, de medio recién calentado (Figura 1M). Repita para todos los insertos. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre la membrana y el medio.
nota: Los cortes de tipo epiléptico se someten a una privación gradual y controlada de suero en el medio. A partir de los 9 días In Vitro (DIV), los cortes se mantienen en NBA sin HS.
2. Registros electrofisiológicos
NOTA: Los registros electrofisiológicos se realizaron en cortes organotípicos de corteza rinal-hipocampo a 7, 14 y 21 DIV en una cámara de tipo interfaz. Las grabaciones se obtuvieron con un amplificador, se digitalizaron y se analizaron con software. Todas las grabaciones fueron filtradas por paso de banda (filtro Bessel de ocho polos a 60 Hz y filtro gaussiano a 600 Hz).
- Preparación de la configuración
- Prepare 50 mL de medio NBA con 1 mL de B27 y 250 μL de L-Glutamina. Calentar a 37 °C.
- Establezca la configuración de electrofisiología en un circuito cerrado. Verifique si el caudal es de 2 mL/min.
- Abra la válvula de la caja (5% CO2/95% O2) y compruebe el nivel de agua en el sistema.
- Coloque el papel de filtro en la cámara de grabación de la interfaz para drenar el exceso de medio y el papel de limpieza de lentes debajo del marco para suministrar medio a la rebanada.
- Encienda el controlador de temperatura, los amplificadores y el micromanipulador.
- Deje que la temperatura en la cámara de interfaz se estabilice a 37 °C antes de comenzar las grabaciones.
- Prepare el líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF: 124 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM de NaH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 10 mM de glucosa, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4 con pH 7,4) y utilícelo para llenar el electrodo de vidrio con una jeringa. Colóquelo en el electrodo receptor.
- Grabaciones de actividad espontánea
- Una vez que la temperatura sea estable, retire la placa de la incubadora y corte una rebanada del inserto con una cuchilla muy afilada. Colócalo en un plato de 60 mm con una gota de medio. Llévelo a la cámara de grabación de la interfaz.
- Coloque la rebanada en la cámara de interfaz con el hipocampo en la parte inferior derecha. Coloque el electrodo receptor en la capa de la celda piramidal CA3.
- Proceda con el protocolo de adquisición continua y registre durante 30 minutos.
