Ensayo de muerte neuronal para evaluar la muerte celular en un modelo de epilepsia ex vivo

Resumen

Fuente: Carvalho, M., et al., Un modelo de epileptogénesis en cultivos de cortes organotípicos de corteza rinal e hipocampo. J. Vis. Exp. (2021)

Este video demuestra la técnica de evaluación de la muerte neuronal en cortes organotípicos de corteza rinal e hipocampo. La muerte neuronal se produce a través de convulsiones epilépticas en evolución, que se asemejan a la epilepsia in vivo, y se detecta mediante la tinción dual de las células muertas mediante yoduro de propidio e inmunofluorescencia.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

1. Preparación de cortezas de corteza rinal-hipocampo

NOTA: La preparación de cortezas de corteza rinal-hipocampo utiliza ratas P6-7 Sprague-Dawley.

1. Montaje del cultivo y preparación del medio
   1. El día antes del cultivo, prepare los medios necesarios y colóquelos a 4 °C.
   2. Preparar el medio de disección: 25 mM de glucosa en la solución salina equilibrada (GBSS) de Gey.
   3. Medio de cultivo preparado: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Suero de caballo (HS), 25 mM de glucosa, 30 μg/mL de gentamicina.
   4. Prepare el medio de mantenimiento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/mL de gentamicina, HS (15%, 10%, 5% y 0%).
2. Sustracción de cerebros
   1. Justo antes de iniciar el cultivo, añada 1,1 mL de medio de cultivo a cada pocillo de la placa de 6 pocillos con una pipeta P1000 y colóquelo a 37 °C.
   2. Coloque todo el equipo (microscopio de disección, picador de tejidos, lámpara de disección, herramientas de disección, electrodos, placas, insertos y papeles de filtro) dentro de la cabina de seguridad biológica y esterilice bajo luz ultravioleta durante 15 minutos.
   3. Ajuste el grosor de la rebanada a 350 μm.
   4. Retira el GBSS de la nevera. Agregue 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Se requerirán seis placas de Petri por animal.
   5. Sacrifica al cachorro de rata. Realizar la decapitación utilizando una tijera afilada en la base del tronco encefálico del animal.
   6. Lave la cabeza del animal tres veces en GBSS frío y llévela dentro del armario de seguridad.
3. Aislamiento de tejidos y preparación de lonchas
   1. Inserte firmemente pinzas afiladas en las cuencas de los ojos para sujetar la cabeza.
   2. Con una tijera fina, corte la piel/cuero cabelludo a lo largo de la línea media desde el agujero vertebral hacia los lóbulos frontales y déjelo a un lado.
   3. Cortar de la misma manera el cráneo y a lo largo de la fisura transversal cerebral (espacio entre el cerebro y el cerebelo). Con pinzas largas curvas, sepárela.
   4. Deseche los bulbos olfativos con una espátula. Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en GBSS helado con la superficie dorsal hacia arriba (Figura 1A).
   5. Inserte las pinzas finas en el cerebelo y recorra la línea media con la espátula abriendo cada hemisferio con mucho cuidado (Figura 1B).
   6. Con pinzas de curva corta, retire con cuidado el exceso de tejido que cubre el hipocampo, sin tocar la estructura del hipocampo. Luego, con una espátula, corte por debajo de cada hipocampo (Figura 1C).
   7. Toma un hemisferio y colócalo, con el hipocampo hacia arriba, sobre un papel de filtro. Repite el procedimiento con el otro hemisferio y colócalo paralelo al primero, en el papel de filtro. Coloque el papel de filtro en la picadora de tejidos, con los hemisferios perpendiculares a la cuchilla, y corte los hemisferios en rodajas de 350 μm (Figura 1D).
   8. Coloque el tejido en rodajas en una placa de Petri con GBSS frío (Figura 1E).
   9. Separe cuidadosamente las rodajas con los electrodos de punta redonda (Figura 1F). Conserve solo las rodajas con una corteza rinal y un hipocampo estructuralmente intactos. Las áreas DG y CA deben estar perfectamente definidas, así como la corteza entorrinal y perirrinal (Figura 1G).
   10. Coloque cada rebanada en el inserto (Figura 1H-I), con una espátula y un electrodo de punta redonda. Retire el exceso de medio de disección alrededor de cada corte con una pipeta P20 (Figura 1J). Se pueden cultivar cuatro cortes de corteza rinal e hipocampo en un solo inserto (Figura 1K).
4. Mantenimiento de la cultura
   1. Cambia el medio cada dos días.
   2. Calentar el medio a 37 °C.
   3. Toma las placas de la incubadora. Levante cada inserto sujetando el borde de plástico con pinzas (Figura 1L).
   4. Use una mano libre para aspirar el medio desde el pozo. Vuelva a colocar el inserto en el pocillo y agregue 1 mL, con una pipeta P1000, de medio recién calentado (Figura 1M). Repita para todos los insertos. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre la membrana y el medio.
      nota: Los cortes de tipo epiléptico se someten a una privación gradual y controlada de suero en el medio. A partir de los 9 días In Vitro (DIV), los cortes se mantienen en NBA sin HS.

2. Ensayo de captación de PI

NOTA: La muerte celular se evaluó mediante el monitoreo de la absorción celular del colorante fluorescente yoduro de propidio (PI). El PI es un compuesto polar, que entra en las células con las membranas celulares dañadas e interactúa con el ADN emitiendo fluorescencia roja (absorbancia 493 nm, emisión 630 nm). Dado que el PI no está destinado a las células vivas, se utiliza para detectar células muertas en una población.

1. Incubación PI
   1. Preparar, en medio de cultivo, una nueva dilución 1:10 de caldo de PI.
   2. Para el ensayo de absorción de PI, retire la placa de la incubadora y levante con cuidado el inserto. Añadir 13 μL de PI al medio, con una pipeta P20, obteniendo una concentración final de 2 μM. Agitar lentamente la placa antes de volver a colocar el inserto. Asegúrese de que no haya burbujas debajo de las rodajas.
   3. Vuelva a colocar las rodajas en la incubadora a 37 °C durante 2 h.
   4. Proceda con el protocolo de inmunohistoquímica, como se describe en la siguiente sección. Cubra las placas con aluminio, ya que el PI es sensible a la luz.

3. Inmunohistoquímica

>NOTA: En inmunohistoquímica, se utilizó un anticuerpo específico de neurona, así como anticuerpos capaces de discriminar fenotipos en reposo y reactivos de microglía y astrocitos, para evaluar el alcance de la muerte neuronal y la gliosis en cortes organotípicos de tipo epiléptico de corteza rinal-hipocampo.

1. Fijación de tejidos
   1. Retire la placa de la incubadora y aspire el medio. Fije las lonchas con un 4% de paraformaldehído (PFA) durante 1 h a RT, añadiendo 1 mL de PFA por debajo y por encima de las lonchas, con una pipeta P1000.
   2. Retire el PFA y agregue 1 mL de PBS. Además, agregue PBS debajo y encima de las rebanadas.
   3. Mantenga las rodajas a 4 °C, en PBS, hasta su uso posterior. Coloque siempre parafilm alrededor de las placas para evitar que se sequen.
2. Pasos de inmunotinción
   1. Lavar dos veces, 10 min cada vez, con 1 mL de PBS.
   2. Prepare una solución de permeabilización/bloqueo que contenga 1% de Triton-X100, 10% de HS y 10% de BSA en PBS. Prepare la solución BSA al 5%.
   3. Dibuje dos rectángulos con el bolígrafo hidrofóbico (Figura 2A). Corte las rodajas del inserto (Figura 2B) con una cuchilla muy afilada. Coloque dos rodajas por portaobjetos (Figura 2C) y añada 140 μL de solución de permeabilización/bloqueo en la parte superior de cada rebanada, utilizando una pipeta P200. Incubar durante 3 h a RT.
   4. Diluir los anticuerpos primarios a la dilución de trabajo en BSA al 5% en PBS. Incubar con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C.
   5. Incubar con los anticuerpos secundarios durante 4 h en RT. A partir de este paso, proteja la placa de la luz, ya que se está trabajando con fluoróforos.
   6. Coloque una gota de 50 μL de solución de Hoechst en la parte superior de cada rebanada e incube durante 20 minutos a RT.
   7. Lavar entre incubaciones. Lave siempre tres veces, durante 10 minutos cada vez, con PBS-T.
   8. Retire Hoechst y lave como se recomienda.
   9. Agregue 50 μL de medio de montaje en la parte superior de cada rebanada. Cubra con un cubreobjetos de vidrio y rodee con esmalte de uñas (Figura 2D).
   10. Déjalo secar a RT durante 24 h.
   11. Visualice la inmunotinción bajo un microscopio confocal. Mantenga las rodajas manchadas a -20 °C.

Resultados

Figura 1: Procedimiento detallado para la preparación de cortes organotípicos de corteza rinal-hipocampo. (A) Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en GBSS helado con la superficie dorsal hacia arriba. (B) Inserte las pinzas en el cerebelo. Abra el cerebro a través de la línea media y elimine el exceso de tejido sobre el hipocampo. (C) Con una espátula cortada por debajo del hi...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de centrífuga de 50 ml, fondo cónico	Corning	430829
70% Etanol	Manuel Vieira, Lda	UN1170
Anti-NeuN (conejo)	Werfen	16712943S	Diluir en una proporción de 1:500
Suplemento B-27™ (50X), sin sérum	Thermo Fisher Scientific	17504-044
Hojas para mango de bisturí	Herramientas de Bellas Ciencias	10011-00
Albúmina sérica bovina (BSA)	NZYTech	MB04602	El 5% de BSA se utiliza para diluir los anticuerpos primarios. Agregue 0,5 g de BSA en 10 mL de PBS.
Sistema de cámara de corte de cerebro/tejido	Instrumentos Warner
Insertos para cultivos celulares, 30 mm, PTFE hidrófilo	Millipore SAS	PICM03050
Fuente de luz fría	Schott	KL 300 LED
Microscopio láser confocal	Zeiss	LSM 710
Incubadora convencional	Thermo Scientific Heraeus	BB15, Línea de función	Ajustado a 37 °C y 5% CO2
D(+)-Glucosa monohidrato	Merck Millipore	1.08342.1000
Solución de D-(+)-glucosa, 45% en agua	sigma	G8769
hidrogenofosfato disódico dihidratado	Merck Milipore	1.06580.1000
Microscopio/lupa de disección	MEIJI TECHNO CO., LTD	122285
Burro anti-conejo IgG (H+L) acoplado a Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	Diluir en una proporción de 1:500
Dumont #5 Pinza Fina Biologie Inox	Herramientas de Bellas Ciencias	11254-20
Pinzas Dumont #5 Standard Inox	Herramientas de Bellas Ciencias	11251-20
Pinzas Dumont #7 Estándar Dumoxel	Herramientas de Bellas Ciencias	11271-30
Pinza de #7S Dumont Medical Curva Corta Inox	Herramientas de Bellas Ciencias	11273-22
Solución madre de gentamicina, 50 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15750-037
Solución salina equilibrada de Gey (GBSS)	Industrias Biológicas	01-919-1A
Electrodos de vidrio	Productos Científicos	GB150F-10	Puntas redondas caseras
Pipetas Pasteur de vidrio, 230 mm	VWR Internacional	612-1702
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)	Thermo Fisher Scientific	24020-091
Suero de caballo, inactivado por calor (HS)
ácido clorhídrico	Thermo Fisher Scientific	26050-088
Bolígrafo hidrofóbico	Merck Milipore	1.09057.1000
Línea INCU IL10	Dako	S200230-2
Espátula de iris curvada	Instrumentos Warner	Tapa BSC-HT Haas
Gabinete de seguridad biológica de clase II de labculture	Herramientas de Bellas Ciencias	10092-12
Papel de limpieza de lentes	HERASafe	SA 12
Solución de L-glutamina 200 mM (Q)	TIFFEN
Micro tubo 0,5 mL, PP	Merck Millipore	1.05886.0500
Micro tubo 1,5 mL, PP	SARSTEDT	72.699
Micro tubo 2.0 mL, PP	SARSTEDT	72.690.001
Miroscopio Cubreobjetos, 24 mm x 60 mm	Instrumento Sutter	MP-285
esmalte	Marienfeld	102242
Medio Neurobasal-A (NBA)	cliché
Opti-MEM® I Sérum Reducido Medio	Thermo Fisher Scientific	10888-022
Paraformaldehído, en polvo	Thermo Fisher Scientific	31985-047
Bomba peristáltica	Productos químicos de VWR	2,87,94,295
Tampón salino de fosfato (PBS)	Gilson	M312
Soluciones estándar de fosfato, PO43- en agua			casero. El PBS con 0,5% de Tween-20 (PBS-T) se utiliza para lavar las rodajas durante el ensayo de inmunohistoquímica.
Juego de pipetas	BDH ARISTAR	452232C
Platino 5 cuchillas	Gilson	P2, P10, P20, P100, P200, P1000
Yoduro de propidio (PI)	Sigma-Aldrich	P5405-250g
Papel de filtro cualitativo, celulosa, grado 1, 55 mm	Sigma-Aldrich	P4170-25MG	Solución madre a 1 mg/mL en agua.
Papel de filtro cualitativo, celulosa, grado 1, 90 mm	Whatman	1001-055	Media retención: 11 μm
Mango de bisturí	Whatman	1001-090	Media retención: 11 μm
Jeringa de insulina con punta deslizante sin aguja 1 mL	Herramientas de Bellas Ciencias	91003-12
Tijeras de estudiante rectas afiladasAfiladas 12cm	Grupo de productos Astro Med Inc GRASS	Estimulador S48
Correderas de adherencia SuperFrost Plus™	Herramientas de Bellas Ciencias	91402-12
Placa de cultivo de tejidos estéril de 60 x 15 mm tratada con TC	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
Placas estériles de 6 pocillos tratadas con TC	Corning	CORN430166
Picadora de pañuelos	CORPORACIÓN DE SISTEMAS MÉDICOS.	TC-102
Tritón X-100	El Laboratorio Mickle Ingeniería CO. LTD.	MTC/2	Ajustado a 350 μm
Preadolescente-20	BDH	14630
	sigma	Página 2287