Ensayo de agregación PolyQ para identificar el efecto neuroprotector de un compuesto en gusanos

Resumen

Fuente: Wang, Q. et al. Caenorhabditis elegans como sistema modelo para descubrir compuestos bioactivos contra la neurotoxicidad mediada por poliglutamina. J. Vis. Exp. (2021)

Este video describe un método in vivo para evaluar el potencial protector de los compuestos de prueba neuroprotectores en la reducción de la agregación de polyQ en las células musculares de la pared corporal de nematodos y mejorar la proteotoxicidad asociada a la agregación.

Protocolo

1. Ensayo de agregación PolyQ

1. Preparación de nematodos para el ensayo de agregación de polyQ
   1. Transfiera de 300 a 500 larvas L1 sincronizadas de AM141 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 μL de medio S que contenga OP50 (OD₅₇₀ de 0,7-0,8) y 5 mg/mL de astragalán, normalmente un pocillo por tratamiento durante un punto de tiempo.
   2. Sellar la placa con parafilm e incubar a 20 °C y 120 rpm durante 24, 48, 72 y 96 h.
   3. Coseche los nematodos en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL y lávelos con tampón M9 >3 veces por centrifugación (1000 × g durante 1 min) para eliminar el OP50 restante. Vuelva a suspender los nematodos AM141 en el búfer M9 y manténgalos listos para la adquisición de imágenes.
2. Adquisición de imágenes fluorescentes y análisis de datos
   NOTA: Los datos se analizan automáticamente con este sistema de imágenes de alto contenido. Si no se dispone de un dispositivo de imagen automatizado, se puede utilizar un método convencional para preparar una almohadilla de agarosa para la adquisición de imágenes con el fin de lograr un rendimiento similar mediante el uso de un microscopio fluorescente común.
   1. Transfiera de 10 a 15 nematodos a cada pocillo en una placa de 384 pocillos (volumen final de 80 μL por pocillo). Establezca 10 pocillos de réplica para cada tratamiento.
   2. Añadir 10 μL de 200 mM de azida sódica a cada pocillo para paralizar los nematodos y permitir que se asienten hasta el fondo (5-10 min).
   3. Coloque la placa en un sistema de imágenes de alto contenido para adquirir imágenes fluorescentes (consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el dispositivo y el software).
   4. Abra el software de adquisición de imágenes y configure los siguientes parámetros.
      1. Abra la ventana Configuración de adquisición de placas y cree un nuevo conjunto de experimentos y un nombre.
      2. Seleccione Ampliación como 2x, Agrupación de la cámara como 1 y Tipo de placa como placa de 384 pocillos.
      3. Establezca los pozos y sitios (un solo sitio) que se van a visitar.
      4. Seleccione el filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) y habilite las opciones de enfoque basadas en imágenes.
      5. Establezca la exposición en 300 ms.
         nota: La configuración anterior se puede probar y ajustar para optimizar los parámetros de imagen.
      6. Guarde la configuración de adquisición de imágenes y haga clic en el botón Adquirir placa para ejecutar.
   5. Analice los datos de la imagen mediante el software de análisis de imágenes.
      1. Abra la ventana Revisar datos de placa y seleccione la placa de prueba para el análisis de imágenes.
      2. Haga doble clic en un pocillo de prueba para mostrar su imagen.
      3. Seleccione Contar núcleos como método de análisis y haga clic en el botón Configurar ajustes para que aparezca una ventana para los siguientes ajustes.
      4. Defina la imagen de origen desde el canal FITC y seleccione el algoritmo estándar.
      5. Establezca los parámetros de análisis de imagen de la siguiente manera: ancho mínimo aproximado = 10 μm (= 2 píxeles); ancho máximo aproximado = 50 μm (= 12 píxeles); intensidad sobre el fondo local = 1.000-2.000 niveles de gris.
      6. Pruebe la configuración actual para optimizar el método de análisis.
      7. Guarde la configuración y ejecute el análisis en todos los pozos.
         nota: Se tarda ~20 minutos en finalizar el análisis de una placa de 384 pocillos.
      8. Exporte los núcleos totales como el número total de agregados Q40::YFP en cada pozo.
   6. Cuente el número de nematodos en cada pozo.
   7. Calcule el número promedio de agregados Q40::YFP por nematodo en cada grupo y aplique un ajuste de curva no lineal a los datos de cada punto de tiempo.
   8. Calcular el índice de inhibición:
      Índice de inhibición = (N_control - N_muestra) / Ncontrol
      Donde N_control y N_muestra son el número promedio de agregados Q40::YFP en los grupos control y tratamiento, respectivamente.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cepa de C. elegans
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
Cepa de E. coli
OP50	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reactivo
Azida de sodio	Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
equipo
Placa de cultivo celular de 384 pocillos	Nido Biotecnología Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
Placa de cultivo celular de 48 pocillos	Nido Biotecnología Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94? _l=en&product_id=85
Microscopio de fluorescencia	Guangzhou Micro-shot Tecnología Óptica Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/ article/442.html
Sistema de imágenes de alto contenido	Dispositivos moleculares	ImageXpress (en inglés)	https://www.moleculardevices.com/ productos/sistemas de imagen celular#Imágenes de alto contenido
Microcentrífuga	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/ index.php/Inicio/Bienes/ goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Microscopio cámara digital	Guangzhou Micro-shot Tecnología Óptica Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
software
Software de adquisición y análisis de imágenes	Dispositivos moleculares	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/ productos/sistemas-de-imagen-celular/ software-de-adquisición-y-análisis/ metaxpress