Artículo de método

Un ensayo para estudiar el efecto del compuesto de prueba contra la neurotoxicidad mediada por PolyQ en gusanos

8 de julio de 2025

En este artículo

Resumen

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Fuente: Wang, Q. et al., >Caenorhabditis elegans como sistema modelo para descubrir compuestos bioactivos contra la neurotoxicidad mediada por poliglutamina. J. Vis. Exp. (2021)

En este video, describimos un método para evaluar el efecto neuroprotector de un compuesto de prueba, el astragalán, sobre la supervivencia neuronal en Caenorhabditis elegans de la neurotoxicidad mediada por poliQ. El ensayo utiliza Caenorhabditis elegans que expresan las repeticiones de polyQ anormalmente expandidas fusionadas con GFP en sus neuronas ASH para medir la supervivencia neuronal después del tratamiento con compuestos de prueba.

Protocolo

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1. Ensayo de neurotoxicidad mediado por PolyQ

  1. Tratamiento de C. elegans con muestras de prueba
    1. A fin de preparar nematodos para el ensayo de neurotoxicidad polyQ, se transfieran 300-500 larvas L1 sincronizadas de HA759 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 μL de medio S que contenga OP50 (OD570 de 0,7-0,8) y 5 mg/mL de astragalán; por lo general, tres pocillos replicados para cada tratamiento.
    2. Sellar la placa con parafilm e incubar a 15 °C y 120 rpm durante 3 días.
    3. Recoja los nematodos por centrifugación y lave de 3 a 5 veces con tampón M9. Resuspender los nematodos en el tampón M9 para su uso en ensayos de supervivencia y evitación neuronal.
  2. Preparación de la almohadilla de agarosa
    1. Añadir 2 g de agarosa a 100 mL de tampón M9 (2%, p/v) y calentar la solución de agarosa en el microondas hasta casi hervir.
    2. Dispensar 0,5 mL de agarosa derretida en el centro de un portaobjetos de vidrio de microscopía de 1 mm de espesor colocado entre dos piezas de placas de vidrio de 2 mm de grosor. Cubra con otro portaobjetos verticalmente. Una vez que la agarosa se enfríe y se solidifique, retire suavemente el portaobjetos superior.
  3. Ensayo de supervivencia neuronal ASH
    1. Agregue una gota de 20 mM de azida de sodio en la almohadilla de agarosa. Transfiera de 15 a 20 nematodos HA759 a la gota para inmovilizarlos.
    2. Coloque un cubreobjetos suavemente sobre los nematodos. Mantenga el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara digital. Seleccione una lente de objetivo de 40x y un filtro FITC para detectar neuronas ASH positivas para GFP en la región de la cabeza de los nematodos.
    3. Seleccione más de 50 nematodos en cada grupo al azar para contar el número de nematodos con neuronas ASH bilaterales marcadas con GFP en su región principal. Calcular la tasa de supervivencia de las neuronas ASH:
      Supervivencia neuronal (%) = figure-protocol-1
      Donde Nde supervivencia y Ntotal son el número de nematodos con neuronas ASH GFP positivas y el número total de nematodos analizados en cada grupo, respectivamente.

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Divulgaciones

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No se han declarado conflictos de interés.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cepa de C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Cepa de E. coli
OP50Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reactivo
agarosaBiooeste111860
Azida de sodioSinopharm Reactivo Químico Co., Ltd.80115560https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af
551e96ff5f07cd
equipo
Placa de cultivo celular de 48 pocillosNido Biotecnología Co., Ltd.748001https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Microscopio de fluorescenciaGuangzhou Micro-shot Tecnología Óptica Co., Ltd.Mshot MF31-LEDhttps://www.mshot.com/article/442.html
Sistema de imágenes de alto contenidoDispositivos molecularesImageXpress Picohttps://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
MicrocentrífugaGeneCompanyGENESPEED X1https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Microscopio cámara digitalGuangzhou Micro-shot Tecnología Óptica Co., Ltd.MS60https://www.mshot.com/article/677.html
microondaMidea Corp. M1-211Ahttps://www.midea.cn/10000/10000000001
Parafilm MSigma-AldrichP7793-1EAhttps://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
software
Software de adquisición y análisis de imágenesDispositivos molecularesMetaXpresshttps://www.moleculardevices.com/ productos/sistemas-de-imagen-celular/ software-de-adquisición-y-análisis/ metaxpress

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