Examinar el comportamiento de quimioevitación en gusanos transgénicos mediante el ensayo de evitación osmótica

Abstract

Fuente: Wang, Q. et al., Z. >Caenorhabditis elegans como sistema modelo para descubrir compuestos bioactivos contra la neurotoxicidad mediada por poliglutamina. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe un ensayo de evitación osmótica para examinar el comportamiento de quimioevitación en un modelo de gusano transgénico. El comportamiento de evitación se prueba en una placa en presencia de una barrera osmótica alta y un quimioatrayente. Los gusanos con una pérdida funcional de neuronas son atraídos por el quimioatrayente, atraviesan la barrera de alta osmótica y se paralizan en la zona de trampa debido a la solución anestésica.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.

>NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver las recetas de soluciones utilizadas en este protocolo.

>1. Preparación de materiales para el ensayo de Caenorhabditis elegans

1. Mantenimiento de cepas de C. elegans
   1. Obtener cepas de C. elegans (AM141 y HA759) y Escherichia coli (OP50 y NA22) (ver la Tabla de Materiales).
   2. Mantenga los nematodos en la placa del medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembrados con E. coli OP50 a 20 °C para AM141 o 15 °C para HA759.
2. Preparación de cultivo bacteriano de E. coli OP50
   1. Elija una sola colonia de E. coli OP50 de una placa de rayas Luria-Bertani (LB) e inocule en 50 mL de cultivo líquido de LB.
   2. Incubar la bacteria OP50 en un agitador a 37 °C y 200 rpm hasta una densidad óptica de ~0,5 a 570 nm (OD₅₇₀).
   3. Almacene el cultivo bacteriano OP50 a 4 °C y utilícelo en un plazo de dos semanas.
3. Preparación de placas NGM con bacterias OP50
   1. Agregue 20 g de agar, 2,5 g de peptona, 3,0 g de NaCl y 975 mL de agua desionizada a una botella esterilizable en autoclave de 1 L. Autoclave a 121 °C durante 30 min.
   2. Coloque el frasco líquido de agar NGM en el banco para que se enfríe a ~ 60 ° C, y luego agregue las siguientes soluciones madre estériles: 1 mL de 1 M de CaCl₂, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 5 mg/mL de colesterol y 25 mL de fosfato de potasio 1 M (pH 6.0).
   3. Vierta 20 mL de NGM en una placa de Petri estéril de 90 mm y deje las placas en el banco para que se enfríen y solidifiquen. Mantenga las placas boca abajo y déjelas secar en el banco a temperatura ambiente durante 2 días.
   4. Dispensar 200 μL del cultivo bacteriano OP50 en cada placa NGM y extenderlo uniformemente con una varilla de recubrimiento de vidrio estéril. Cierre las tapas e incube las placas durante la noche a 37 °C.
   5. Guarde las placas NGM sembradas con OP50 en una caja de plástico con tapa a temperatura ambiente y utilícelas dentro de las dos semanas.
4. Preparación de la población de C. elegans sincronizada por edad
   1. Recoja los nematodos adultos grávidos en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y centrifugue a 1000 × g durante 1 min. Lave tres veces y vuelva a suspender los nematodos en el tampón M9.
   2. Agregue un volumen igual de solución de lejía y agite suavemente durante 3-5 min. Controle el blanqueo cada 15 s bajo un microscopio de disección><. nota: La solución de lejía debe prepararse recién hecha antes de su uso mezclando volúmenes iguales de 10% de NaOCl y 1 M de NaOH (Tabla 1).
   3. Una vez que la mayoría de los nematodos se hayan roto, detenga la digestión diluyéndola con tampón M9. Centrifugar rápidamente para eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en tampón M9 para repetir el lavado tres veces.
   4. Vuelva a suspender el pellet en medio S. Deje que los residuos de nematodos se asienten por gravedad durante 2-3 minutos mientras los huevos permanecen en el sobrenadante.
   5. Aspire el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Recoger los huevos por centrifugación a 1000 × g durante 1 min.
   6. Deseche ~ 80% del sobrenadante y transfiera los huevos a un matraz estéril que contenga 20 mL de medio S. Colocar el matraz en un agitador e incubar los huevos durante la noche sin alimento a 120 rpm para obtener nematodos L1 sincronizados.

2. Ensayos de neurotoxicidad mediados por PolyQ

1. Tratamiento de C. elegans con muestras de prueba
   1. Para preparar nematodos para el ensayo de neurotoxicidad polyQ, transfiera 300-500 larvas L1 sincronizadas de HA759 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 μL de medio S que contenga OP50 (OD570 de 0,7-0,8) y 5 mg/mL de astragalano, normalmente tres pocillos replicados para cada tratamiento.
   2. Sellar la placa con parafilm e incubar a 15 °C y 120 rpm durante 3 días.
   3. Recoja los nematodos por centrifugación y lave de 3 a 5 veces con tampón M9. Resuspender los nematodos en el tampón M9 para su uso en ensayos de supervivencia y evitación neuronal.
Ensayo de evitación osmótica
1. Divida una placa NGM sin alimentos (9 cm) en zonas normales (N) y atrapadas (T) por una línea de glicerol de 8 M (~30 μL) en el medio. Extienda una línea de 200 mM de azida sódica (~20 μL) a ~1 cm de distancia de la línea de glicerol para paralizar los nematodos que atraviesan la barrera de glicerol hacia la Zona T.
2. Transfiera ~ 200 nematodos cada uno a la Zona N de tres placas replicadas para cada grupo. Agregue una gota de butanediona al 1% (~ 2 μL) en la zona T (a 1 cm del borde de la placa) para atraer a los nematodos. Cubra la tapa de la placa de Petri inmediatamente e incube a 23 °C durante 90 min.
3. Marque el número de nematodos en las zonas N y T bajo un microscopio. Calcule el índice de evitación usando eq.
   Índice de evitación = N / (T + N)
   Donde N y T son el número de nematodos en las zonas N y T, respectivamente. Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (DE) de tres repeticiones, representativas de >3 experimentos independientes.
4. Realice una prueba t de dos colas no apareada para comparar los datos de los grupos de astragalán y control.

Tabla 1:

solución	Instrucciones de preparación	almacenamiento
1 M CaCl2	111 g CaCl2	Almacenar a temperatura ambiente (RT)
	Añadir dH2O a 1 L
	autoclave
1 M Fosfato de potasio (pH 6.0)	108.3 g KH2PO4	Almacenar en RT
	35.6 K2HPO4
	Añadir dH2O a 1 L
	autoclave
1 M MgSO4	246 g MgSO4·7H2O	Almacenar en RT
	Añadir dH2O a 1 L
	autoclave
Colesterol en etanol (5 mg/mL)	0,5 g Colesterol	Almacenar a -20 °C
	Agregue etanol a 100 mL
	¡No lo haga en autoclave!
1 M Citrato de potasio (pH 6.0)	Añadir 10,0 g de ácido cítrico monohidrato	Almacenar en RT
	Añadir 146,75 g de ácido cítrico tripotásico monohidrato
	Añadir dH2O a 1 L
	autoclave
Solución de metales traza	0,93 g de EDTA disódico	Almacenar en la oscuridad en RT
	0,345 g FeSO4·7H2O
	0,1 g MnCl2·4H2O
	0,145 g ZnSO4·7H2O
	Añadir 0,0125 g CuSO4·5H2O
	Añadir dH2O a 500 mL
	autoclave
1 M NaOH	4 g de NaOH	Almacenar en RT
	Añadir dH2O a 100 mL
Solución de lejía	0,5 mL de NaOH 1 M	Preparar fresco antes de usar
	0,5 mL de NaOCl al 10%
Búfer M9	5 g de NaCl	Almacenar en RT
	3 g KH2PO4
	6 g Na2HPO4
	Añadir dH2O a 1 L
	autoclave
	Añadir 1 mL de 1 M MgSO4
>S basal	5,85 g de NaCl	Almacenar en RT
	6.0 g KH2PO4
	1,0 g K2HPO4
	Añadir dH2O a 973 mL
	Autoclave y enfriamiento a ~60 °C
	Agregue 1 mL de 5 mg/mL de colesterol en etanol
S medio	S basal	Almacenar en RT
	Añadir 3 mL de 1 M de CaCl2
	Añadir 3 mL de 1 M MgSO4
	Añadir 10 mL de citrato de potasio 1 M
	Agregue 10 mL de solución de metales traza
	Todos los componentes han sido esterilizados en autoclave, no lo haga en autoclave
5 mg/mL de astragán	0,1 g de astragán	Almacenar en alícuotas a -80 °C
	Añadir 20 mL de medio S
	Filtro a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm
200 mM de azida sódica	1,3 g NaN3	Almacenar a 4 °C
	Agregue 100 mL de medio S
8 M Glicerol	73,67 g de glicerol	Almacenar en RT
	Añadir dH2O a 100 mL
10% Stock de butanediona	Mezclar 10 μL de butanediona con 90 μL de dH2O	Tienda en RT
1% Butanediona	Añadir 10 μL de caldo de butanediona a 90 μL de dH2O	Tienda en RT
1 L de cultivo Luria-Bertani (LB)	10 g de NaCl	Almacenar en RT
	10 g de triptona
	5 g Extracto de levadura
	Añadir dH2O a 1 L
	autoclave

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cepas de C. elegans
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/HA759
Cepas de E. coli
NA22	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reactivo
agar-agar	Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Butanediona	Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb 595d0
colesterol	Sigma-Aldrich	C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
glicerol	Aladdin Co., Ltd.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
peptona	Guangdong HuanKai Ciencia y Tecnología Microbiana Co., Ltd.	050170B	https://www.huankai.com/show/21074.html
Azida de sodio	Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
hidróxido sódico	Sinopharm Reactivo Químico Co., Ltd.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6
Solución de hipoclorito de sodio	Fábrica de reactivos químicos de Guangzhou	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Triptona	Oxoid Ltd.	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Extracto de levadura	Oxoid Ltd.	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
equipo
Placa de cultivo celular de 48 pocillos	Nido Biotecnología Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
Placa de Petri de 90 mm	Sangon Biotech (Shanghái) Co., Ltd.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
autoclave	Panasonic	MLS-3781L-PC
Microscopio de disección	ChongQing Óptica Co., Ltd.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Microcentrífuga	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
sacudidor	Zhicheng Inc.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html