Todos los procedimientos que involucran modelos animales han sido revisados por el comité institucional local de cuidado de animales y la junta de revisión veterinaria de JoVE.
>NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver las recetas de soluciones utilizadas en este protocolo.
>1. Preparación de materiales para el ensayo de Caenorhabditis elegans
- Mantenimiento de cepas de C. elegans
- Obtener cepas de C. elegans (AM141 y HA759) y Escherichia coli (OP50 y NA22) (ver la Tabla de Materiales).
- Mantenga los nematodos en la placa del medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembrados con E. coli OP50 a 20 °C para AM141 o 15 °C para HA759.
- Preparación de cultivo bacteriano de E. coli OP50
- Elija una sola colonia de E. coli OP50 de una placa de rayas Luria-Bertani (LB) e inocule en 50 mL de cultivo líquido de LB.
- Incubar la bacteria OP50 en un agitador a 37 °C y 200 rpm hasta una densidad óptica de ~0,5 a 570 nm (OD570).
- Almacene el cultivo bacteriano OP50 a 4 °C y utilícelo en un plazo de dos semanas.
- Preparación de placas NGM con bacterias OP50
- Agregue 20 g de agar, 2,5 g de peptona, 3,0 g de NaCl y 975 mL de agua desionizada a una botella esterilizable en autoclave de 1 L. Autoclave a 121 °C durante 30 min.
- Coloque el frasco líquido de agar NGM en el banco para que se enfríe a ~ 60 ° C, y luego agregue las siguientes soluciones madre estériles: 1 mL de 1 M de CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 5 mg/mL de colesterol y 25 mL de fosfato de potasio 1 M (pH 6.0).
- Vierta 20 mL de NGM en una placa de Petri estéril de 90 mm y deje las placas en el banco para que se enfríen y solidifiquen. Mantenga las placas boca abajo y déjelas secar en el banco a temperatura ambiente durante 2 días.
- Dispensar 200 μL del cultivo bacteriano OP50 en cada placa NGM y extenderlo uniformemente con una varilla de recubrimiento de vidrio estéril. Cierre las tapas e incube las placas durante la noche a 37 °C.
- Guarde las placas NGM sembradas con OP50 en una caja de plástico con tapa a temperatura ambiente y utilícelas dentro de las dos semanas.
- Preparación de la población de C. elegans sincronizada por edad
- Recoja los nematodos adultos grávidos en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y centrifugue a 1000 × g durante 1 min. Lave tres veces y vuelva a suspender los nematodos en el tampón M9.
- Agregue un volumen igual de solución de lejía y agite suavemente durante 3-5 min. Controle el blanqueo cada 15 s bajo un microscopio de disección><.
nota: La solución de lejía debe prepararse recién hecha antes de su uso mezclando volúmenes iguales de 10% de NaOCl y 1 M de NaOH (Tabla 1).
- Una vez que la mayoría de los nematodos se hayan roto, detenga la digestión diluyéndola con tampón M9. Centrifugar rápidamente para eliminar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en tampón M9 para repetir el lavado tres veces.
- Vuelva a suspender el pellet en medio S. Deje que los residuos de nematodos se asienten por gravedad durante 2-3 minutos mientras los huevos permanecen en el sobrenadante.
- Aspire el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga estéril. Recoger los huevos por centrifugación a 1000 × g durante 1 min.
- Deseche ~ 80% del sobrenadante y transfiera los huevos a un matraz estéril que contenga 20 mL de medio S. Colocar el matraz en un agitador e incubar los huevos durante la noche sin alimento a 120 rpm para obtener nematodos L1 sincronizados.
2. Ensayos de neurotoxicidad mediados por PolyQ
- Tratamiento de C. elegans con muestras de prueba
- Para preparar nematodos para el ensayo de neurotoxicidad polyQ, transfiera 300-500 larvas L1 sincronizadas de HA759 a cada pocillo de una placa de 48 pocillos con 500 μL de medio S que contenga OP50 (OD570 de 0,7-0,8) y 5 mg/mL de astragalano, normalmente tres pocillos replicados para cada tratamiento.
- Sellar la placa con parafilm e incubar a 15 °C y 120 rpm durante 3 días.
- Recoja los nematodos por centrifugación y lave de 3 a 5 veces con tampón M9. Resuspender los nematodos en el tampón M9 para su uso en ensayos de supervivencia y evitación neuronal.
Ensayo de evitación osmótica
- Divida una placa NGM sin alimentos (9 cm) en zonas normales (N) y atrapadas (T) por una línea de glicerol de 8 M (~30 μL) en el medio. Extienda una línea de 200 mM de azida sódica (~20 μL) a ~1 cm de distancia de la línea de glicerol para paralizar los nematodos que atraviesan la barrera de glicerol hacia la Zona T.
- Transfiera ~ 200 nematodos cada uno a la Zona N de tres placas replicadas para cada grupo. Agregue una gota de butanediona al 1% (~ 2 μL) en la zona T (a 1 cm del borde de la placa) para atraer a los nematodos. Cubra la tapa de la placa de Petri inmediatamente e incube a 23 °C durante 90 min.
- Marque el número de nematodos en las zonas N y T bajo un microscopio. Calcule el índice de evitación usando eq.
Índice de evitación = N / (T + N)
Donde N y T son el número de nematodos en las zonas N y T, respectivamente. Los datos se presentan como medias ± desviación estándar (DE) de tres repeticiones, representativas de >3 experimentos independientes.
- Realice una prueba t de dos colas no apareada para comparar los datos de los grupos de astragalán y control.
Tabla 1:
| solución | Instrucciones de preparación | almacenamiento |
| 1 M CaCl2 | 111 g CaCl2 | Almacenar a temperatura ambiente (RT) |
| Añadir dH2O a 1 L |
| autoclave |
| 1 M Fosfato de potasio (pH 6.0) | 108.3 g KH2PO4 | Almacenar en RT |
| 35.6 K2HPO4 |
| Añadir dH2O a 1 L |
| autoclave |
| 1 M MgSO4 | 246 g MgSO4·7H2O | Almacenar en RT |
| Añadir dH2O a 1 L |
| autoclave |
| Colesterol en etanol (5 mg/mL) | 0,5 g Colesterol | Almacenar a -20 °C |
| Agregue etanol a 100 mL |
| ¡No lo haga en autoclave! |
| 1 M Citrato de potasio (pH 6.0) | Añadir 10,0 g de ácido cítrico monohidrato | Almacenar en RT |
| Añadir 146,75 g de ácido cítrico tripotásico monohidrato |
| Añadir dH2O a 1 L |
| autoclave |
| Solución de metales traza | 0,93 g de EDTA disódico | Almacenar en la oscuridad en RT |
| 0,345 g FeSO4·7H2O |
| 0,1 g MnCl2·4H2O |
| 0,145 g ZnSO4·7H2O |
| Añadir 0,0125 g CuSO4·5H2O |
| Añadir dH2O a 500 mL |
| autoclave |
| 1 M NaOH | 4 g de NaOH | Almacenar en RT |
| Añadir dH2O a 100 mL |
| Solución de lejía | 0,5 mL de NaOH 1 M | Preparar fresco antes de usar |
| 0,5 mL de NaOCl al 10% |
| Búfer M9 | 5 g de NaCl | Almacenar en RT |
| 3 g KH2PO4 |
| 6 g Na2HPO4 |
| Añadir dH2O a 1 L |
| autoclave |
| Añadir 1 mL de 1 M MgSO4 |
| >S basal | 5,85 g de NaCl | Almacenar en RT |
| 6.0 g KH2PO4 |
| 1,0 g K2HPO4 |
| Añadir dH2O a 973 mL |
| Autoclave y enfriamiento a ~60 °C |
| Agregue 1 mL de 5 mg/mL de colesterol en etanol |
| S medio | S basal | Almacenar en RT |
| Añadir 3 mL de 1 M de CaCl2 |
| Añadir 3 mL de 1 M MgSO4 |
| Añadir 10 mL de citrato de potasio 1 M |
| Agregue 10 mL de solución de metales traza |
| Todos los componentes han sido esterilizados en autoclave, no lo haga en autoclave |
| 5 mg/mL de astragán | 0,1 g de astragán | Almacenar en alícuotas a -80 °C |
| Añadir 20 mL de medio S |
| Filtro a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm |
| 200 mM de azida sódica | 1,3 g NaN3 | Almacenar a 4 °C |
| Agregue 100 mL de medio S |
| 8 M Glicerol | 73,67 g de glicerol | Almacenar en RT |
| Añadir dH2O a 100 mL |
| 10% Stock de butanediona | Mezclar 10 μL de butanediona con 90 μL de dH2O | Tienda en RT |
| 1% Butanediona | Añadir 10 μL de caldo de butanediona a 90 μL de dH2O | Tienda en RT |
| 1 L de cultivo Luria-Bertani (LB) | 10 g de NaCl | Almacenar en RT |
| 10 g de triptona |
| 5 g Extracto de levadura |
| Añadir dH2O a 1 L |
| autoclave |
