Ensayo de heridas para evaluar la capacidad migratoria de mioblastos murinos en cocultivo

Resumen

Fuente: Toubat, O. et al., Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe un ensayo de cicatrización de heridas de cocultivo sin contacto para evaluar la capacidad migratoria de mioblastos murinos. Esto ayuda a comprender los componentes de envío y recepción de señales de las interacciones de señalización Wnt paracrinas no canónicas in vitro.

Protocolo

1. Ensayo de heridas:

(La Figura 1 describe el modelo esquemático del ensayo)

1. Permita que los insertos de células O9-1 y los pozos de la cámara celular C2C12 se adhieran y proliferen en la incubadora hasta que ambas células estén en confluencia de ~70-80% antes de continuar con esta parte del protocolo. Si las células crecen >90% confluentes, no proceda con el ensayo de rasguño, ya que las células simplemente se desprenderán del pocillo.
2. Caliente 1x PBS y C2C12 medio colocándolos en un baño de agua a 37 °C.
3. Retire bien el medio sobrenadante de la cámara C2C12 y lave las celdas una vez con 1x PBS. Retire el 1x PBS y rasque inmediatamente las células con una punta de pipeta P10 estéril.
   1. Pase la punta de la pipeta estéril P10 firmemente en una sola dirección para abarcar toda la longitud o el ancho de la monocapa celular (p. ej., de derecha a izquierda, de arriba a abajo). Asegúrese de rascar cada pocillo que contenga células solo una vez.
      nota: Para optimizar los resultados de rayado, rasque pocillos de diferentes condiciones experimentales a un nivel similar de confluencia. Para hacer esto, asegúrese de que cada pozo de 4 cámaras tenga celdas para cada condición experimental requerida (por ejemplo, pozo # 1 control negativo, pozo # 2 control positivo). Además, utilice una nueva pipeta P10 estéril para cada rasguño y aplique una cantidad similar de fuerza a la pipeta cada vez. No intente crear más de un rasguño en cada pozo.
   2. Después de rascar, agregue rápidamente 1 ml de 1x PBS nuevamente al pocillo con una punta de pipeta P1000. Repita este proceso para cada pozo que se raye.
      nota: Dada la variabilidad asociada a cada rasguño, se recomienda el uso de múltiples pocillos (n = 3) para la creación de heridas en cada condición experimental. Trabaje con rapidez, ya que es fundamental minimizar la duración durante la cual las celdas están sin 1x PBS durante estos pasos. Después de eliminar 1x PBS de cada pocillo, no se deben tardar más de 5 segundos en generar una herida en cada pocillo.
4. Después de generar una herida y agregar 1x PBS nuevamente en cada pocillo, obtenga una imagen del rasguño con un microscopio invertido de campo claro y use esta imagen como el tamaño de la herida de referencia (tiempo 0). Para tomar imágenes, realice los siguientes pasos:
   1. Encienda la computadora y el microscopio (consulte la Tabla de materiales) presionando el botón de encendido. Coloque la corredera de la cámara en el escenario y gire el dial del objetivo a un aumento de 5x.
   2. Abra el software de creación de imágenes (consulte la Tabla de materiales) haciendo doble clic en el icono del software en el escritorio de la computadora. Haga clic en la pestaña Cámara en la pantalla de inicio del software. Haga clic en el botón Live para visualizar las celdas en la pestaña AxioCam IC.
   3. Asegúrese de que el filtro de luz esté completamente extraído para permitir que la luz pase a la cámara y a la pantalla de la computadora. Mueva y/o gire manualmente el portaobjetos de la cámara para colocar el área de la herida en el centro de la imagen en vivo en la pestaña AxioCam IC.
   4. Para tomar imágenes, haga clic en ajustar para abrir una nueva pestaña junto a la pestaña IC de AxioCam que contiene la imagen.
   5. Para guardar esta imagen fija, haga clic en archivo en la parte superior izquierda de la página de inicio del software | guardar como | introduzca el nombre del archivo en el cuadro de nombre del archivo. Guarde la figura en formato de imagen de Carl Zeiss (*.czi) (la configuración predeterminada) y seleccione escritorio en la barra de la izquierda para guardar el archivo en el escritorio como un archivo .czi, que solo se puede abrir en el programa de software Zen lite 2012.
   6. Para guardar la imagen como una .tiff, haga clic en archivo | guardar como | introduzca el nombre del archivo en el cuadro de nombre de archivo. Guarde la figura como archivo de imagen etiquetado (*.tiff) haciendo clic en el botón guardar como tipo y seleccionando *.tiff en el menú desplegable.
      nota: El formato .tiff se puede abrir en cualquier software de procesamiento de imágenes.
   7. Vuelva a colocar manualmente el portaobjetos de la cámara para tomar 2-3 imágenes más en otros puntos de la herida en el mismo pocillo.
      nota: En total, esto dará como resultado 3-4 imágenes no superpuestas y de gran aumento de la herida en cada pocillo.
5. Retire el 1x PBS de cada pocillo y agregue 1 mL de C2C12 medium.
   nota: Tenga cuidado de no pipetear de forma demasiado agresiva al retirar o añadir soluciones al pocillo de la cámara después de la generación de la herida, ya que esto puede hacer que las células se desprendan del pocillo de la cámara. Además, incline la cámara de manera que la aspiración y la reintroducción de soluciones se puedan realizar en las esquinas de cada pocillo para minimizar la interrupción de la monocapa celular.
6. Ensamble el sistema de cocultivo de insertos de pocillos colocando manualmente los insertos que contienen las celdas de O9-1 en cada pocillo del pocillo de la cámara. Empuje suavemente los insertos hacia abajo en el pocillo de modo que la parte inferior del inserto quede justo por encima de las celdas C2C12 subyacentes. Devuelva las construcciones de inserto de pocillo a la incubadora.
   nota: No permita que la parte inferior del inserto toque físicamente y altere mecánicamente las celdas C2C12 subyacentes.
7. Permita que las células migren durante un total de 9-12 h. Para determinar el tiempo óptimo de migración, revise las células a las 6 h después de la creación de la herida, luego cada 2-3 h a partir de entonces. Finalice el experimento cuando las células en condiciones de control o control positivo comiencen a cubrir completamente la herida.
   nota: Dada la naturaleza sin contacto del constructo, no es necesario retirar el inserto suprayacente de los pozos al verificar la progresión de la migración del intervalo. La variabilidad migratoria se observará dependiendo de factores como los tipos de células utilizados en este ensayo, la densidad celular en el momento de la generación de la herida, el ancho de la herida creada y las condiciones experimentales de las células manipuladas (por ejemplo, knockdown de genes, adición de proteínas recombinantes). Las concentraciones de estos reactivos deben determinarse experimentalmente con la orientación de las recomendaciones del fabricante.

Resultados

Figura 1: Modelo esquemático del ensayo.El paso 1 incluye la expansión in vitro de mioblastos C2C12 y NCC utilizando células alimentadoras STO. El paso 2 consiste en la siembra de células NCC y C2C12 en el sistema de cocultivo. El paso 3 incluye el ensayo de herida realizado en las células C2C12 subyacentes para evaluar la capacidad migratoria celular. El paso 4 consiste en la inmunotinción ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular de mioblastos murinos C2C12	ATCC	CRL-1772
Sistema de corredera de cámara, 4 pocillos	ThermoFisher Scientific	154526
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), glucosa alta (4,5 g/L), lglutamina (2 mM)	Corning	10-017-CV	Almacenado a 4 °C
Puntas de pipeta graduadas y estériles, 10 μL	Científico de EE. UU	Teléfono 1111-3810
Línea celular de cresta neural O9-1	Millipore Sigma	SCC049
Solución salina tampón fosfato (PBS), 1x, sin calcio ni magnesio, pH 7,4	Corning	21-040-CV	Almacenado a 4 °C
Soporte permeable Falcon para placa de 24 pocillos con membrana de PET transparente de 0,4 μM	Corning	353095
Suero fetal bovino	Fisher Científico	W3381E	Almacenado en alícuotas de 50 mL a -20 °C
Microscopio óptico invertido Zeiss Axio Vert.A1	Carl Zeiss AG
Software de microscopía Zen lite 2012	Carl Zeiss AG		Software de procesamiento de imágenes

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