Ensayo de inmunoabsorción enzimática para verificar conjugados anticuerpo-antígeno acoplados químicamente

Resumen

Fuente: Volckmar, J. et al., Conjugación química de un anticuerpo dirigido DEC-205 purificado con proteína de longitud completa para atacar células dendríticas de ratón in vitro e in vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Este video muestra la detección de complejos anticuerpo-antígeno químicamente conjugados a través de la técnica de ensayo de inmunoabsorción enzimática sándwich, o ELISA. El anticuerpo capturado se une al epítopo específico del antígeno del conjugado anticuerpo-antígeno, que puede visualizarse posteriormente utilizando un anticuerpo secundario ligado a una enzima.

Protocolo

1. Producción de αDEC-205 a partir de la línea celular de hibridoma NLDC-145

1. Para la producción de anticuerpos, descongele las células NLDC-145 criopreservadas que producen αDEC-205 a 37 °C en un baño de agua. Expanda las celdas a 37 °C y 5% de CO₂. Se necesitarán dos frascos de^{75 cm2} para proceder a la producción de anticuerpos. Los procedimientos de cultivo celular deben realizarse en una cabina de seguridad para garantizar condiciones de trabajo seguras y evitar la contaminación de los cultivos.
   1. Resuspender 1 mL de células descongeladas (1 x 10⁶ - 5 x 10⁶ células/mL) en 9 mL de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) en un matraz de cultivo celular (25^cm2). Colocar el matraz horizontalmente en una incubadora de cultivos celulares a 37 °C, 5% CO₂.
   2. Cultivar las células a 37 °C y 5% de CO₂, hasta un 70% de confluencia. Normalmente, esto debe lograrse después de 24 a 48 h.
   3. Una vez que las células tengan un 70 % de confluentez, transfiera la suspensión completa de células NLDC-145 (10 ml) a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml utilizando un controlador de pipeta con una pipeta en un rango de volumen de 1 a 10 ml. Granular las células por centrifugación a 250 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
   4. Precalentar el medio ISF-1 a 37 °C en un baño de agua y resuspender el pellet en 12 mL de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1%. Transfiera la suspensión celular resuspendida a un matraz de cultivo celular fresco (75^cm2).
   5. Cultivar y expandir las células en medio ISF-1 suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C y 5% de CO₂, hasta que el 70% confluente y el 99% sean viables. Normalmente, esto debería lograrse después de 48 a 72 h.
   6. Divida las celdas en dos matraces de^{75 cm 2}. Para hacer esto, primero enjuague el fondo del matraz/superficie de cultivo con la suspensión celular para eliminar todas las células NLDC-145 de la superficie. Transfiera 6 mL de la suspensión celular NLDC-145 a uno de los dos frascos frescos de 75^cm2 y agregue medio ISF-1 precalentado suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% hasta 12 mL.
      nota: No renueve el medio de cultivo celular ya que las células NLDC-145 habrán acondicionado el medio. Transfiera las células junto con su medio y llene el cultivo hasta el volumen deseado con medio fresco. Esto es crucial para la viabilidad y la máxima producción de anticuerpos por parte de las células NLDC-145.
   7. Expandir los cultivos celulares a 37 °C y 5% de CO₂, hasta que aproximadamente el 70% confluente, lo que generalmente se logra después de 48 a 72 h.
   8. Una vez que las células estén confluentes en un 70%, transfiera 10 mL de la suspensión celular NLDC-145 expandida de cada uno de los frascos de 75^cm2 a una botella de rodillo de PETG (tereftalato de polietilenoglicol) (1,050^cm2). Para ello, enjuague el fondo del matraz/superficie de cultivo con la suspensión celular para eliminar todas las células de la superficie utilizando un controlador de pipeta y una pipeta de 10 mL.
   9. Añadir 140 mL de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) directamente del frasco mediano a cada uno de los frascos de rodillo que contienen NLDC-145, llenándolos hasta la marca de 150 mL.
      nota: Consulte la nota en el paso 1.1.6.
   10. Cultive los frascos con rodillo a 37 °C, 5% de CO₂ y 25 rondas/min durante tres días.
   11. Añadir 150 mL de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) a cada uno de los frascos de rodillo que contienen NLDC-145, llenándolos hasta la marca de 300 mL.
   12. Cultive los frascos con rodillo que ahora contienen 300 mL de cultivo cada uno a 37 °C, 5% de CO₂ y 25 rondas/min durante otros tres días.
   13. Añadir otros 100 mL de medio ISF-1 suplementado con penicilina/estreptomicina al 1% (precalentado a 37 °C) a cada uno de los frascos con rodillo que contienen NLDC-145, llenándolos así hasta la marca de 400 mL.
   14. Cultive los frascos de rodillo que ahora contienen 400 mL de cultivo cada uno a 37 °C, 5% de CO₂ y 25 rondas/min durante otros siete días.
       nota: Durante esta semana, el cultivo se vuelve muy denso (hasta un 95% de densidad) y la viabilidad disminuye (hasta tan solo un 50%), lo que permite la máxima liberación de anticuerpos.
2. Para la purificación de αDEC-205 a partir del sobrenadante de cultivo, vierta la suspensión de celdas NLDC-145 (de ambos frascos de rodillos) directamente en frascos de centrifugación autoclave de 500 mL.
   nota: Se debe recolectar un volumen total de 800 mL de cultivo.
   1. Centrifugar el cultivo durante 30 min a 8.600 x g y 4 °C para eliminar las células y los residuos.
   2. Recoja los sobrenadantes, deseche los gránulos y agrupe los sobrenadantes en un frasco de reactivo estéril.
      nota: La purificación de αDEC-205 puede iniciarse inmediatamente (paso 2) o el sobrenadante puede almacenarse a corto plazo a 4 °C.

2. Purificación del anticuerpo αDEC-205 a partir del sobrenadante celular NLDC-145

NOTA: A partir del sobrenadante celular NLDC-145, αDEC-205 se purifica utilizando una columna de proteína G Sepharose (reutilizable). Las dimensiones de la columna son 15 mm x 74 mm y se empaquetan 5 mL de proteína G Sepharose por columna.

1. Para la preparación y el lavado de la columna de proteína G Sepharose, coloque un tapón de goma hermético en la abertura superior de la columna de proteína G Sepharose. Perfore el tapón de goma con dos cánulas estériles (20 G x 1 1/2", 0,90 x 40 mm).
   1. Conecte una jeringa de 10 mL a una de las dos cánulas y un tubo de silicona flexible (de aproximadamente 100 cm de largo, 2,5 - 3 mm de diámetro) con un conector de tubo a la segunda cánula.
      nota: La construcción de la jeringa/tapón de goma es reutilizable y proporciona un vacío que da como resultado un flujo continuo del gran volumen de sobrenadante de cultivo a la columna de proteína G Sepharose. Para ello, tire ligeramente hacia atrás del émbolo de la jeringa para garantizar un flujo continuo de fluido en los siguientes pasos.
   2. Lave la columna con 50 mL de ácido acético glacial 0,1 M (pH 2) para eliminar los anticuerpos potencialmente restantes de cualquier purificación de anticuerpos anterior. Coloque el extremo del tubo de silicona en el frasco de reactivo lleno de ácido acético glacial (pH 2) de 0,1 M. Como resultado del vacío inducido, 50 mL de ácido acético glacial (pH 2) de 0,1 M recorren gota a gota la columna de proteína G Sepharose.
      NOTA: El ácido acético glacial 0,1 M (pH 2) debe almacenarse en un frasco de reactivo o recién llenado en un vaso de precipitados.
   3. Lave la columna con 100-200 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Coloque el extremo del tubo de silicona en una botella de reactivo o vaso de precipitados lleno de PBS. Deje que 100-200 mL de PBS corran gota a gota a través de la columna de proteína G Sepharose.
2. Para la purificación de anticuerpos a partir del sobrenadante NLDC-145, cargue 800 mL del sobrenadante NLDC-145 (obtenido del paso 1.2.2.) en la columna. Coloque el extremo del tubo de silicona en el frasco de reactivo lleno de sobrenadante NLDC-145. Deje que el sobrenadante NLDC-145 de 800 mL corra gota a gota a través de la columna.
   1. Lave la columna con 500 mL de PBS. Coloque el extremo del tubo de silicona en un frasco o vaso de precipitados lleno de PBS. Deje que 500 ml de PBS corran gota a gota a través de la columna.
   2. Para la elución, utilice 20 tubos de 1,5 mL y pipetee 100 μL de Tris-HCl de 1,5 M (pH 8,8) en cada tubo de 1,5 mL. Retire el tapón de goma de la columna y pipetee 1 mL de glicina 0,1 M (pH 3) en la cámara superior de la columna de proteína G Sepharose para eluir el anticuerpo de la columna. Recoja el flujo directamente como eluido en uno de los tubos de 1,5 ml preparados.
   3. Repita el paso de elución (2.2.2.) para los 20 tubos (1,5 mL).
   4. Determine la densidad óptica de todas las fracciones de elución a 280 nm (OD₂₈₀) utilizando un espectrofotómetro para identificar las fracciones que contienen anticuerpos><. nota: Utilice la primera fracción de elución como blanco.
   5. Agrupe todas las fracciones con un OD₂₈₀ mayor que 0,5 (aproximadamente 10 fracciones).
   6. Almacene la columna de proteína G Sepharose llena de etanol al 20% a 4 °C.
3. Diálisis de las eluciones agrupadas contra 1000 mL de PBS (en un vaso de precipitados de 2000 mL) a 4 °C durante la noche utilizando un tubo de diálisis con un corte de peso molecular (MWCO) de 12 a 14 kDa.
   1. Corte el tubo de diálisis en trozos de 20 cm. Hervir el tubo de diálisis en 500-800 mL de EDTA de 10 mM (pH 7,5) durante 30 min en un vaso de precipitados utilizando una placa caliente para eliminar la contaminación. Deseche la solución de EDTA de 10 mM (pH 7,5) y hierva el tubo de diálisis en agua desionizada durante 10 min.
      nota: El tubo de diálisis puede utilizarse directamente o almacenarse en una solución de azida sódica (NaN₃)/H₂O al 0,01% a 4 °C hasta el próximo uso.
   2. Cierre la parte inferior del tubo de diálisis con un cierre de tubo de diálisis adecuado/pinza articulada de una sola pieza y pipetee cuidadosamente el eluido de anticuerpos en el tubo de diálisis. Cierre la parte superior del tubo de diálisis con una segunda pinza.
   3. Fije la pinza superior del tubo de diálisis a un soporte flotante, júntela con una barra de agitación magnética en el vaso de precipitados lleno de PBS y coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético.
   4. Diálisar durante la noche agitando a 4 °C.
4. Para aumentar la concentración de αDEC-205, cargue el dializado completo en un concentrador centrífugo con MWCO de 10 kDa. Abra una abrazadera del tubo y pipetee cuidadosamente el dializado completo del tubo de diálisis en el concentrador centrífugo (10 kDa MWCO).
   nota: No toque el fondo del concentrador con la punta de la pipeta.
   1. Centrífuga durante 30 min a 693 x g (2.000 rpm) y 4 °C.
   2. Cargue el concentrador centrífugo con 10 mL de PBS y centrifugue a 693 x g (2.000 rpm) y 4 °C hasta que el volumen final de solución de anticuerpos restante sea de 1-1,5 mL.
      nota: Si es necesario, repita el paso de centrifugación de 2.4.1. para ajustar a la cantidad deseada.
   3. Usando un espectrofotómetro, determine la densidad óptica de la solución concentrada de αDEC-205 a 280 nm (OD₂₈₀). Utilice PBS como espacio en blanco.
   4. Calcule la concentración de αDEC-205 utilizando la siguiente fórmula:
      concentración [mg/mL] = OD₂₈₀/1,4.
   5. Filtre la solución αDEC-205 con una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
      nota: La purificación de αDEC-205 del sobrenadante de células de hibridoma NLDC-145 también se puede lograr mediante FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas). El αDEC-205 purificado puede almacenarse a 4 °C o a -18 °C para su almacenamiento a largo plazo.

3. Conjugación química de OVA a αDEC-205

NOTA: Se requiere una proporción de 0,5 mg de proteína OVA por 2,5 mg de αDEC-205 (1:5) para una conjugación química óptima. Sin embargo, esta proporción puede variar para otras proteínas y anticuerpos y debe optimizarse para conjugados alternativos. La reducción de los enlaces disulfuro de la proteína OVA se realiza mediante incubación con 30 mM de TCEP-HCl, que expone los grupos sulfhidrilo para la conjugación química a αDEC-205 y se necesitan 240 μl de TCEP-HCl en el paso 3.2. Ambos pasos, la reducción de OVA inducida por TCEP (paso 3.1.) y la activación de sulfo-SMCC de αDEC-205 (paso 3.2.) deben realizarse preferiblemente en paralelo.

1. Prepare una solución de TCEP-HCl de 125 mM (pH 7,0). Pesar la cantidad deseada de TCEP-HCl y disolver el TCEP-HCl en una base de Tris de 0,9 M (pH 8,8). Utilice tiras indicadoras de pH para probar el pH de la solución de TCEP-HCl de 125 mM (que debe ser neutra) y ajuste el pH con la base Tris (pH 8,8).
   1. Pipetear 200 μL de solución de proteína OVA (que contiene 0,5 mg de OVA) en un tubo estéril de 1,5 mL. Añadir 240 μl de TCEP-HCl de 125 mM y 560 μL de agua ultrapura estéril a la proteína OVA utilizando una pipeta hasta una concentración final de 0,5 mg/mL de proteína OVA y 30 mM de TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      NOTA: 2,5 mg de OVA EndoGrade (liofilizado) se disuelven en 1 mL de PBS, lo que da como resultado una solución de OVA de 2,5 mg/mL.
   2. Incubar el OVA/TCEP-HCl resultante a temperatura ambiente durante 1,5 h.
      nota: No extienda este paso de incubación.
2. Para activar αDEC-205 para la conjugación, disuelva 2 mg de sulfo-SMCC en 100 μL de agua ultrapura.
   nota: Sulfo-SMCC es susceptible a la hidrólisis. Por lo tanto, se deben manejar rápidamente cantidades mayores de sulfo-SMCC no disuelto o se deben usar alícuotas disponibles de 2 mg.
   1. Diluya αDEC-205 en PBS de modo que 2,5 mg queden contenidos en 900 μL.
   2. Mezclar 2,5 mg de αDEC-205 (900 μL de volumen; obtenido en el paso 3.2.1.) y 100 μL de sulfo-SMCC (obtenido en el paso 3.2.) en un tubo de 1,5 mL, obteniendo un volumen total de 1 mL.
   3. Incubar la solución αDEC-205/sulfo-SMCC durante 30 minutos a 37 °C y 550 rpm en un bloque calefactor.
3. Después de estas incubaciones, el exceso de sulfo-SMCC y TCEP-HCl se elimina inmediatamente de las soluciones utilizando columnas de desalinización (MWCO 7 kDa; volumen de columna de 5 mL).
   1. Gire el cierre inferior de las columnas (MWCO 7 kDa), afloje la tapa y coloque la columna en un tubo cónico de 15 mL.
   2. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g a temperatura ambiente para eliminar el líquido.
   3. Coloque la columna en un tubo nuevo y retire la tapa. Cargue lentamente el anticuerpo/sulfo-SMCC y el OVA/TCEP-HCl, respectivamente, en el centro del lecho de resina compacta de una columna cada uno.
   4. Centrifugar durante 2 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.
   5. Deseche las columnas después de su uso. Las soluciones que contienen anticuerpos y OVA preparadas para la conjugación se encuentran en los tubos.
   6. Mezcle inmediatamente ambas soluciones mediante pipeteo para la conjugación de αDEC-205 y OVA.
   7. Incubar la mezcla resultante de αDEC-205 y OVA durante la noche a 4 °C.
4. Después de la conjugación, el exceso de OVA no unido se elimina de la solución y el αDEC-205/OVA acoplado se concentra utilizando un concentrador de proteínas centrífugo (MWCO 150 kDa).
   1. Enjuague previamente el concentrador de proteínas centrífugo (MWCO 150 kDa) pipeteando 12 mL de PBS en la columna y centrifugando durante 2 min a 2.000 x g a temperatura ambiente.
      nota: Si es necesario, repita la etapa de centrifugación (3.4.1.) hasta que un volumen de aproximadamente 5 mL haya pasado a través de la columna.
   2. Antes de cargar el αDEC-205/OVA en el concentrador de proteínas centrífugo, guarde una muestra de 20 μL del αDEC-205/OVA no concentrado para el análisis de Western blot. Almacene esta alícuota a 4 °C hasta el análisis.
   3. Cargue el αDEC-205/OVA en el concentrador de proteínas centrífugo mediante pipeteo.
      nota: Evite cualquier contacto con el lecho de la cámara superior del concentrador centrífugo.
   4. Llene el concentrador hasta 15 ml con PBS y centrifugue el concentrador durante 5 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente.
   5. Guarde una muestra del flujo de paso (flujo a través I) para el análisis de Western blot y descarte el flujo de paso restante.
   6. Llene el concentrador hasta 10 ml con PBS y centrifugue el concentrador durante al menos 8 minutos a 2.000 x g a temperatura ambiente.
   7. Guarde una muestra para el segundo flujo (flujo a través II) para el análisis de Western blot y deseche el flujo restante.
   8. Una vez que se haya logrado el enriquecimiento deseado (se debe dejar alrededor de 1,5 mL de la solución de αDEC-205/OVA en la cámara superior), aspire suavemente la muestra concentrada.
      nota: Si queda demasiado líquido en la cámara superior, se puede repetir la centrifugación, pero debe mantenerse lo más corta posible.
5. Determine la concentración de proteínas de la αDEC-205/OVA resultante utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes. Utilice PBS como espacio en blanco.
6. Filtre el αDEC-205/OVA con una unidad de filtro de jeringa de 0,22 μm.
   nota: Para análisis posteriores y experimentos in vivo, αDEC-205/OVA puede almacenarse a 4 °C o -18 °C.

4. Verificación de la conjugación química por ELISA

1. Realice ELISA para una verificación adicional de la conjugación química exitosa que da como resultado αDEC-205 / OVA.
2. Cubra una placa ELISA apropiada de 96 pocillos con 100 μL/pocillo de 3 ng/μL de anticuerpo αOVA de conejo en tampón de recubrimiento (bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO₃), pH 9,6, diluido en_H2O).
   1. Incubar la placa durante la noche a 4 °C.
3. Después del recubrimiento, lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, con una arandela ELISA.
4. Bloquee la placa pipeteando 200 μL de tampón de bloqueo (10% FCS en PBS) en cada pocillo de la placa e incube la placa durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Diluir en serie αDEC-205/OVA (obtenido en el paso 3.6.) 1:2 en tampón de bloqueo (10% FCS en PBS) para obtener diluciones que van desde 6 μg/mL hasta 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA y añadir 100 μL/pocillo de estas cantidades decrecientes de αDEC-205/OVA a los pocillos.
   1. Incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, con una arandela ELISA.
7. Añada 100 μL del anticuerpo αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO de cabra (diluido a 1:2.000 en tampón de bloqueo (10% FCS en PBS)) a cada pocillo de la placa.
   1. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
8. Lave la placa tres veces con PBS, por ejemplo, con una arandela ELISA.
9. Agregue 50 μL de sustrato HRPO a los pocillos. Al observar una reacción de color claro, detenga la reacción mediante la adición de 150 μl de solución de detención (1M H₂SO₄) por pocillo.
10. Después de 5 minutos, lea la absorción a 450 nm usando un lector ELISA.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Búfer de bloqueo (ELISA)			10 % FBS en PBS
matraz para cultivo celular T25	Greiner Bio-One	690175	utilizamos matraces de cultivo celular con tapón de filtro CELLSTAR estándar; alternativamente, utilice matraces de cultivo en suspensión (690195 )
matraz para cultivo celular T75	Greiner Bio-One	658175	utilizamos matraces de cultivo celular con tapón de filtro CELLSTAR estándar; alternativamente, use matraces de cultivo en suspensión (658195)
Matraz para cultivo celular T175	Greiner Bio-One	661175	utilizamos matraces de cultivo celular con tapa de filtro CELLSTAR estándar; alternativamente use matraces de cultivo en suspensión (661195)
Concentrador centrífugo MWCO 10 kDa	sartorio	VS2001	Concentrador centrífugo Vivaspin 20
Concentrador centrífugo de proteínas MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml	Thermo Fisher Scientific	88532	Pierce Concentrador de Proteínas, PES 5 -20 ml; utilizamos el Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (número de catálogo 89921), que sin embargo ya no está disponible
Botellas centrífugas	Nalgene	Números 525-2314	PPCO (copolímero de polipropileno) con cierre de rosca de PP (polipropileno), 500 ml; obtenido de VWR, Alemania
Tampón de recubrimiento (ELISA)			0,1 M de bicarbonato sódico (NaHCO3) en H2O (pH 9,6)
Columnas de desalinización MWCO 7 kDa	Thermo Fisher Scientific	89891	Columnas de desalinización por centrifugado Thermo Scientific Zeba, 7K MWCO, 5 mL
Reactivo de detección ELISA (sustrato HRPO)	Sigma-Aldrich/Merck	T8665-100ML	Sistema de sustrato líquido de 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB)
Placa ELISA de 96 pocillos	Thermo Fisher Scientific	442404	Placa MaxiSorp Nunc-Immuno
Suero fetal de ternera	PAN-BIOtech	P40-47500	FBS Buen fuerte
ISF-1 medio	Biochrom/bioswisstec	F 9061-01
Hibridoma NLDC-145	ATCC	HB-290	si aún no están a mano, las células de hibridoma se pueden adquirir de ATCC
ovoalbúmina	Hyglos (a través de BioVendor)	321000	EndoGrade OVA ultrapuro con <0,1 UE/mg
Penicilina/Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Gibco Penicilina/Estreptomicina 10.000 U/ml; alternativamente se puede utilizar Gibco Penicilina/Estreptomicina 5.000 U/ml (15070-063)
Frascos de rodillo de cultivo celular de tereftalato de etilenglicol PETG	Nunc In Vitro	734-2394	Con recubrimiento de PDL estándar, ventilado (1,2X), 1050 cm², volumen de 100 a 500 ml; obtenido de VWR, Alemania
Tiras indicadoras de pH	Merck	109535	Tiras indicadoras de pH 0-14
Anticuerpo policlonal αrat-IgG+IgM-HRPO de cabra policlonal (ELISA)	Jackson ImmunoResearch	112-035-068	obtenido en Dianova, Alemania; utilizado a escala 1:2000 para ELISA
Conejo policlonal αOVA (ELISA)	Abcam	AB181688	Utilizado a 3 ng/μl
Columna de proteína G sefarosa	Merck/Millipore	P3296	5 ml de Proteína G Sepharose, Fast Flow se envasan en una columna vacía PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)
Tapón de goma	Omnilaboratorio	5230217	Tapones de goma DEUTSCH & NEUMANN (Φ inferior 17 mm; Φ superior 22 mm)
Tubo de silicona	Omnilaboratorio	5430925	DEUTSCH & NEUMANN (interior Φ 1 mm; exterior Φ 3 mm)
Adelgazamiento			hemos utilizado Slim-Fast Chocolate regular disponible gratuitamente en la farmacia, ya que en este enfoque de Western blot dio mejores resultados que la leche en polvo
Solución de detención (ELISA)			1M H2SO4
Sulfo-SMCC	Thermo Fisher Scientific	22322	Reticulante Pierce Sulfo-SMCC; alternativamente use el número de catálogo A39268 (10 x 2 mg)
Unidad de filtro de jeringa 0,22 μm	Merck/Millipore	SLGV033RS	Unidad de filtro de jeringa Millex-GV, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, esterilizado con rayos gamma
Jeringa 10 ml	Omnilaboratorio		Jeringas desechables Injekt® Solo B.Braun
Cánulas estériles®	B. Braun		Estéril® G 20 x 1 1/2""; 0,90 x 40 mm; amarillo
TCEP-HCl	Thermo Fisher Scientific	A35349
Conector de tubo	Omnilaboratorio		Conectores de tubo en miniatura Kleinfeld para tubo de silicona

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