Ensayo Comet para la detección de daños en el ADN en células

Resumen

Fuente: Ji, Y., et al. Un enfoque de ensayo de cometas de alto rendimiento para evaluar el daño del ADN celular. J. Vis. Exp. (2022).

El video muestra el ensayo del cometa para detectar daños en el ADN después de la exposición a agentes nocivos. En condiciones alcalinas, el ADN se desenrolla y se desnaturaliza, y tras la electroforesis, el ADN dañado y no dañado migra de manera diferente en el gel de agarosa, formando una estructura en forma de cometa. El ADN no dañado que migra lentamente forma la cabeza circular del cometa, mientras que los fragmentos de ADN dañados que migran rápidamente forman la cola alargada del cometa.

Protocolo

1. Preparación de materiales para el ensayo del cometa

1. Preparación de los portaobjetos del microscopio
   1. Vierta el 1% (p/v) de agarosa de punto de fusión normal [disuelta en agua bidestilada (ddH₂O)] en un tubo de 50 mL y cocine en el microondas para disolver la agarosa en el ddH₂O. Almacene a 37 °C para evitar la solidificación antes de los portaobjetos de recubrimiento. En caso de solidificación, deséchelo y prepárelo fresco.
   2. Revise previamente los portaobjetos del microscopio sumergiéndolos en el tubo de 50 ml que contiene un 1% (p/v) de agarosa en el punto de fusión normal.
   3. Limpie la parte posterior de los portaobjetos rápidamente después de sumergirlos.
      nota: Si no se limpia correctamente la parte posterior de los portaobjetos, aumentará el ruido de fondo de los portaobjetos durante el paso de análisis con microscopio.
   4. Etiquete el portaobjetos recubierto con un marcador permanente en la esquina inferior derecha de la sección esmerilada (Figura 1A). Esto muestra qué lado de la diapositiva está prerrecubierto.
   5. Deje que la agarosa se asiente y se seque durante la noche a temperatura ambiente.
   6. Envuelva los portaobjetos secos en papel de seda y guárdelos en una caja.

2. Preparación de muestras

1. Células cultivadas
   nota: En primer lugar, trate las células con el agente o agentes dañinos antes de comenzar el ensayo del cometa. A continuación, realice lo siguiente.
   1. Si las células son adherentes, tripsinícelas para liberarlas del matraz de cultivo celular o de las placas de Petri de cultivo celular, en la confluencia adecuada de células. Neutraliza la tripsina añadiendo medios que contengan suero.
   2. Transfiera las células a un tubo de 50 ml, centrífugo (por ejemplo, para HaCaTs, centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente), retire suavemente el sobrenadante y agregue 1 mL de PBS al pellet de la celda.
   3. Realice el recuento de células.
   4. Transfiera 30.000 células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y centrifugue a 7.607 x g durante 5 min a 4 °C.
   5. Retire suavemente el sobrenadante y almacene la pastilla de celda en hielo en la oscuridad antes de realizar el ensayo del cometa.
      nota: Las células deben ser examinadas regularmente para detectar la contaminación por Mycoplasma antes de realizar el ensayo del cometa para prevenir, entre otros efectos, la formación de daños artefactuales en el ADN y la alteración de la respuesta al daño del ADN, como se ha informado. Las condiciones de centrifugación pueden cambiar, según sea necesario, dependiendo del tipo de célula utilizada.
2. Preparación de células cultivadas para el ensayo de reparación
   1. Células de cultivo en el matraz de cultivo celular o placas de Petri.
   2. Lave las células con 1 mL de PBS dos veces antes de tratar las células con agentes dañinos (por ejemplo, para las células BE-M17, tratar con 50 μM de H₂O₂ durante 20 min) con hielo para evitar que se produzca la reparación durante el tratamiento.
   3. Lave las células suavemente con 1 ml de PBS dos veces para eliminar cualquier agente dañino residual.
   4. Vuelva a introducir el medio de cultivo celular y deje que las células se repare durante períodos variables (por ejemplo, 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h y 30 h) en una incubadora humidificada (37 °C, 5% CO₂).
   5. En cada punto de tiempo, recoja 30.000 células en un medio de cultivo celular que contenga dimetilsulfóxido (DMSO) al 10% y guárdelas a -80 °C.
   6. Antes de realizar el ensayo del cometa, descongele las células rápidamente a 37 °C en un baño de agua y centrifuérrelas a 7.607 x g durante 5 minutos a 4 °C.
   7. Retire el sobrenadante y almacene el pellet de celda en hielo antes de realizar el ensayo (es decir, desde el paso 3).

3. Lisis celular

NOTA: Realice todos los trámites en hielo.

1. Utilice 12.000 células o 2,5 μL de sangre entera por gel.
2. Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% (p/v) disuelta en PBS usando un microondas y colóquela en un baño de agua a 37 °C para evitar que se solidifique.
3. Etiquete el extremo esmerilado de los portaobjetos prerrecubiertos con el nombre del investigador, la fecha y la información del tratamiento con un marcador permanente o un lápiz.
4. Coloque una placa de enfriamiento en un banco plano e inserte los dos paquetes de enfriamiento congelados en el cajón deslizante debajo de la superficie metálica (como se muestra en la Figura 2).
5. Coloque los portaobjetos en la placa de enfriamiento y deje que los portaobjetos se enfríen previamente durante 1-2 minutos antes de agregar las celdas que contienen agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% (p/v)
   nota: Dejar los portaobjetos en la placa de enfriamiento durante más de 1-2 minutos puede hacer que se forme condensación en la superficie del portaobjetos debido a la humedad ambiental. Esto puede hacer que los geles de agarosa de bajo punto de fusión sean menos estables en los portaobjetos.
6. Disperse el pellet (paso 2.2.7) por vórtice. Asegúrese de que se haya eliminado todo el sobrenadante del pellet. Vuelva a colocar los tubos de muestra (que contienen las células granuladas) inmediatamente en hielo.
   nota: Al colocar los tubos que contienen muestras en la centrífuga, colóquelos con la bisagra hacia afuera para que el pellet se recoja en este lado del tubo. A veces es difícil ver la bolita y es fácil desalojarla mientras se retira el sobrenadante. Centrifugar con la tapa del tubo en esta orientación permitirá saber dónde estará el pellet de la celda.
7. Vuelva a suspender el pellet celular con 200 μL de agarosa de bajo punto de fusión al 0,6% (agarosa LMP) y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas. A continuación, transfiera rápidamente 80 μL de células que contienen agarosa LMP a un portaobjetos refrigerado y coloque rápidamente un cubreobjetos en el gel.
8. Deje que el gel se asiente en la placa de enfriamiento durante 1-2 minutos.
9. Mientras tanto, prepare una solución de trabajo de 500 mL de tampón de lisis (Tabla 1) y viértala en la placa de lisis (Figura 3).
10. Una vez que los geles se hayan fijado, retire los cubreobjetos rápidamente sosteniendo suavemente el portaobjetos entre el pulgar y el índice y deslizando el cubreobjetos fuera del gel.
11. Coloque los portaobjetos que contienen muestras dentro del portaobjetos (todas las marcas negras de "puntos" en los portaobjetos deben estar orientadas en la misma dirección cuando se colocan en un portador) (Figura 1B) y luego coloque el portaobjetos dentro de la placa de lisis (Figura 3).
12. Cierre la tapa de la placa de lisis y manténgala en el refrigerador durante la noche a 4 °C o 30 min a temperatura ambiente, lo que mejor se adapte al horario del operador.

4. Electroforesis

1. Retire con cuidado el portaobjetos de la placa de lisis. Tenga cuidado de no alterar los geles.
2. Coloque suavemente el portaobjetos en un plato de lavado precargado con ddH₂O helado y déjelo actuar durante 30 minutos, asegurándose de que los portaobjetos estén completamente cubiertos con ddH₂O.
3. Inserte un paquete de enfriamiento congelado dentro del cajón deslizante debajo del tanque de electroforesis para mantener la temperatura óptima del tampón.
4. Agregue con cuidado la solución de trabajo de electroforesis helada (Tabla 1) al tanque de electroforesis y transfiera el portaobjetos al tanque de electroforesis. Oriente los portaobjetos de manera que sus partes transparentes con los geles que contienen celdas (es decir, NO los extremos esmerilados/etiquetados) apunten hacia el cátodo (electrodo rojo).
5. Deje que los portaobjetos permanezcan en el tanque de electroforesis durante 20 minutos para que el ADN se relaje y se relaje. Mantenga la fuente de alimentación apagada durante este paso.
6. Si es necesario, inserte un nuevo paquete de enfriamiento congelado para maximizar el enfriamiento.
7. Realice la electroforesis durante 20 min a 1,19 V/cm, o las condiciones que se hayan optimizado.
   nota: Se recomienda la optimización de las condiciones de funcionamiento de la electroforesis y del volumen de tampón para todos los laboratorios. El uso de un solo portaobjetos durante la electroforesis no causa ningún efecto de los portaobjetos en la resistencia del tampón de electroforesis, y los autores no observaron un efecto significativo en el voltaje o la corriente cuando cambió el número de portaobjetos.
8. Apague la fuente de alimentación, retire con cuidado el portaobjetos del tanque de electroforesis y deje que se drene en papel de seda durante 30 s.
9. Coloque el portaobjetos en el plato que contiene el tampón de neutralización (Tabla 1). Déjalo actuar durante 20 min.
10. Retire el portaobjetos del plato de neutralización, colóquelo en el plato de lavado que contiene ddH2O helado y déjelo actuar durante 20 minutos.
11. Retire el portaobjetos del agua y deje que los portaobjetos se sequen en una incubadora a 37 °C durante 1 h, o a temperatura ambiente durante la noche, o no los seque, según el horario del operador><. nota: Si no hay secado en el paso 4.11, realice el paso de tinción de 5.2.

5. Tinción de yoduro de propidio (PI)

1. Transfiera el portaobjetos a un plato de lavado que contenga ddH₂O helado para rehidratar los portaobjetos y déjelo actuar durante 30 min.
2. Coloque el portaobjetos en un plato de tinción que contenga 2,5 μg/mL de solución de yoduro de propidio.
   nota: El yoduro de propidio es sensible a la luz, así que manéjelo en un área oscura. También es tóxico.
3. Cierre la tapa del plato de tinción e incube durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
4. Transfiera el portaobjetos a un plato aparte y lávelo con ddH₂O helado durante 20 minutos.
5. Retire el portaobjetos de la placa y séquelo completamente a oscuras, ya sea en una incubadora a 37 °C o a temperatura ambiente, según el horario o las preferencias del operador.
6. Una vez que las diapositivas estén completamente secas, retírelas del portaobjetos y guárdelas en una caja de diapositivas en la oscuridad hasta que estén listas para el análisis de imágenes><. nota: Las diapositivas permanecerán legibles indefinidamente y se pueden volver a teñir si es necesario.

6. Puntuación de cometas y análisis de datos

NOTA: El término "cometa" deriva de las imágenes de las células dañadas cuando se ven bajo un microscopio después de que se ha realizado el ensayo (Figura 4). En condiciones de electroforesis, el ADN de las células no dañadas no migra en gran medida, sino que permanece en un esferoide denominado "cabeza" de cometa. Sin embargo, la presencia de roturas de hebras permite que el ADN de la célula migre fuera de la cabeza y forme una "cola", lo que lleva a una apariencia similar a la de un cometa (Figura 4). Cuanto más ADN hay en la cola, más daño hay.

1. Encienda el microscopio de fluorescencia con el filtro PI (rojo) (λ = 536/617 nm) y el software de puntuación del ensayo del cometa.
2. Agregue una gota de agua con una pipeta Pasteur al gel y cúbralo con un cubreobjetos.
3. Coloque los portaobjetos en el microscopio de fluorescencia y "marque" los cometas.
   nota: La puntuación es un medio por el cual se evalúan los cometas, para determinar la cantidad de daño presente en cada cometa. En términos generales, esto se puede lograr mediante el uso de dos enfoques, de acuerdo con la preferencia elegida por el usuario, ya sea a ojo (midiendo el tamaño de los cometas en una escala de cero a cuatro) o mediante el uso de software libre o disponible comercialmente30. En general, ambos enfoques evalúan el tamaño de la cola del cometa, aunque se puede determinar una variedad de puntos finales relacionados con el cometa. Si utiliza el software, haga clic en el centro de la cabeza del cometa y espere hasta que el software detecte el cometa automáticamente y luego evalúe el punto final elegido (Figura 4).
4. Puntúa 50 cometas por gel y 100 cometas por muestra (es decir, cada muestra corresponde a diferentes tratamientos que dañan el ADN, o sus réplicas).
5. Replicar los experimentos (n = 2) o triplicar los experimentos (n = 3).
   nota: Si solo se realizan n = 2 experimentos replicados, no se puede realizar un análisis estadístico, pero si n = 3, se realiza la prueba de normalidad de D'agostino. La mayoría de los datos de ensayos de cometas no pasan una prueba de normalidad. En este caso, utilice una prueba no paramétrica (prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn y pruebas de significación de Mann-Whitney establecidas en p < 0,05).

Reactivo	Solución de stock	Solución de trabajo
Tampón de lisis	100 mM de Na2EDTA, 2,5 M de NaCl y 10 mM de Tris Base en ddH2O; ajuste el pH a 10 con 10 M de NaOH	Triton X-100 al 1% en solución madre de lisis
Tampón de electroforesis	10 M de NaOH y 200 mM deNa2EDTA en ddH2O	300 mM de NaOH y 1 mM deNa2de EDTA; pH > 13
Tampón de neutralización	0.4 M Tris Base en ddH2O; ajuste el pH a 7.5 con HCl
Tampón de tinción	1 mg/mL de yoduro de propidio	2,5 μg/mL de yoduro de propidio en ddH2O

Tabla 1: Composición de los reactivos utilizados en el ensayo de cometas alcalinos de alto rendimiento (HTP ACA). Se muestran las concentraciones de stock y trabajo de los tampones de lisis, electroforesis, neutralización y tinción.

Resultados

Figura 1: Imágenes representativas de un portaobjetos de ensayo de cometas y un bastidor HTP (portador de portaobjetos de microscopio). (A) Para una orientación correcta, la cara prerrevestida del portaobjetos del microscopio se reconoce mediante un punto negro en la esquina derecha de un portaobjetos del microscopio. (B) La imagen del bastidor HTP ilustra cómo los portaobjetos se mantienen en una or...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm	Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.	631-0124
Microscopio de fluorescencia equipado Con una cámara	Zeiss, Jena, Alemania
Sistema de ensayo HTP Comet	Cuchilla Científica	COMPAC- 50
Queratinocito humano (HaCaTs)	Colección de Cultura Tipo Americana (ATCC), Manassas, VA, EE. UU.	terminado	Se puede comprar en otro empresa ADDEXBIO TECHNOLOGIES Gato# T0020001
Peróxido de hidrógeno (H2O2) 30% en agua	Fisher Scientific, Hampton, NH, EE. UU.	BP2633-500
Software de análisis de imágenes y datos	Instrumento Perceptivo, Bury St Edmunds, Inglaterra, Reino Unido	125525	Software gratuito de análisis de imágenes is disponible, por ejemplo, ImageJ
Agarosa de bajo punto de fusión	Invitrogen Waltham, MA, Estados Unidos	P4864
Na2 EDTA (disodio ácido etilendiaminotetraacético)	Sigma Aldrich, San Luis, MO, Estados Unidos	E5134
NaCl (cloruro de sodio)	Sigma Aldrich, San Luis, MO, Estados Unidos	S7653
Nanopure Infinity Agua ultrapura Sistema (Barnstead Nanopure)	Thermo Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos	D11901	Agua ultrapura (16 MΩ cm^{-1} )
NaOH (hidróxido de sodio)	Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	E5134
Punto de fusión normal Agarosa	Fisher Scientific, Hampton, NH, ESTADOS UNIDOS	16520100	Para portaobjetos de pre-recubrimiento
Yoduro de propidio (1,0 mg/mL en agua)	Sigma Aldrich, San Luis, MO, Estados Unidos	12-541BP486410ML
Microscopio de vidrio esmerilado simple Diapositivas	Fisher Scientific, Hampton, NH, ESTADOS UNIDOS	12-541B
Caja deslizante	Fisher Scientific, Hampton, NH, ESTADOS UNIDOS	03-448-2	A prueba de luz, para proteger las células de la formación de daño adventicio (según la opinión generalizada) y evitar el desvanecimiento del fluorescente teñir
Placa de enfriamiento deslizante	Cleaver Scientific, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	CSL-CHILLPLATE
Plato de tratamiento	Cleaver Scientific, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	STAINDISH4X
Tris-base	Sigma Aldrich, San Luis, MO, Estados Unidos	93362
Tritón X-100	Fisher Scientific, Hampton, NH, ESTADOS UNIDOS	BP151-500
Tripsina EDTA (0,5%)	Invitrogen Gibco, Waltham, MA, Estados Unidos	15400054
Portaobjetos vertical	Cleaver Scientific, Rugby, Inglaterra, Reino Unido	COMPAC-25