El uso de materiales radiactivos (RAM) requiere la aprobación previa de un comité de seguridad designado en cada institución.
1. Absorción de aminoácidos en las células
- Placa 5 x 104 células ST2 en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Células placa en α-MEM que contienen 10% de FBS, 100 U/mL de penicilina y 0,1 μg/mL de estreptomicina (Pen/Strep). Coloque pocillos adicionales de células para cuantificar el número de células por condición para las normalizaciones del paso 1.12. Incubar las células en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37 °C con 5% de CO2.
- Cultive las células durante 2-3 días hasta que confluenten.
- El día del experimento, prepare las siguientes soluciones: 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 y tampón Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, NaHCO3, 5 mM de HEPES, 1 mM de D-glucosa). Precalentar a 37 °C.
- Aspirar el medio y lavar las células dos veces con 1 mL de 1x PBS, pH 7.4.
nota: Este protocolo también es apropiado para dividir rápidamente células no confluentes. En este caso, es importante normalizar la radiactividad al número absoluto de células o al contenido de ADN. Además, considere aumentar el tamaño de la placa o matraz de cultivo para aumentar el número total de células y los valores de cpm. Es importante determinar esto empíricamente de forma individual.
- Aspire 1x PBS y lave las células una vez con 1 mL de KRH.
- Producir 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-Glutamina diluyendo 4 μL de [1 μCi μL-1] de L-[3,4-3 H]-Glutamina por 1 mL de KRH.
nota: Antes de usar materiales radiactivos, comuníquese con la Oficina de Seguridad Radiológica de su institución de origen para obtener aprobaciones. Todos los procedimientos relacionados con la radiación deben realizarse detrás del blindaje de plexiglás.
- Incubar las células con 0,5 mL de KRH que contengan 4 μCi/mL de L-[3,4-3 H]-glutamina durante 5 min.
- Recoja el medio radiactivo y dispense en el contenedor de residuos líquidos. Lave las células tres veces brevemente con KRH helado para terminar la reacción. Recoja y deseche todos los lavados en el contenedor de residuos líquidos radiactivos.
- Añadir 1 mL de SDS al 1% a cada pocillo y triturar 10x para lisar y homogeneizar las células. Transfiera los lisados celulares a tubos de 1,5 mL. Deseche las placas de cultivo celular, las pipetas serológicas y las puntas de pipeta en el contenedor de residuos radiactivos sólidos.
- Centrifugar a >10.000 x g durante 10 min. Transfiera los sobrenadantes a viales de centelleo que contengan 8 mL de la solución de centelleo. Mezcle agitando vigorosamente los viales de centelleo. Deseche los tubos y las puntas de pipeta en el contenedor de residuos radiactivos sólidos.
- Lea la radiactividad en recuentos por minuto (cpm) usando un contador de centelleo. Deseche los viales de centelleo en el contenedor de residuos de viales de centelleo.
- Tripsinizar, resuspender y contar las células de las placas no radiactivas restantes de células (ver paso 1.1) para estimar el número de células en los cultivos radiactivos lisados. Usando un hemocitómetro, cuente el número de células por pocillo no radiactivo para cada condición experimental. Normalice el cpm desde el paso 1.11 hasta el número estimado de células de las placas no radiactivas.
- Una vez finalizado el experimento, descontamine la campana de cultivo celular, el banco y todos los instrumentos con un aerosol descontaminante de radiactividad. Finalmente, realice pruebas de limpieza para asegurarse de que el área de trabajo esté libre de radiación.
