Ensayo colorimétrico para la cuantificación de lactato en muestras de ensayo

Resumen

Fuente: Yanase, S., et al. Ensayos colorimétricos a pequeña escala de lactato y piruvato intracelulares en el nematodo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Este video describe un ensayo colorimétrico para la medición de lactato en lisados celulares mediante el uso de la enzima lactato deshidrogenasa. Esta enzima convierte el lactato en piruvato, junto con la conversión de NAD en NADH que reacciona con los colorantes de tetrazolio y da un producto coloreado que se puede medir espectrofotométricamente para cuantificar el lactato.

Protocolo

1. Cultivo sincronizado de C. elegans

1. Antes de la siembra, cultive la cepa OP50 de Escherichia coli (E. coli) durante la noche a 37 °C en 300 mL de medio líquido de caldo Luria-Bertani (LB). Almacene el OP50 cultivado a -4 °C.
   1. Para hacer un medio líquido de caldo LB, use 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 1,5 mL de NaOH 1 N, y agregue 1 L con agua desionizada. Autoclave.
      nota: Las cepas OP50 y C. elegans están disponibles en el Centro de Genética de Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, St. Paul, MN, EE. UU.).
2. Para hacer agar medio de crecimiento de nematodos (NGM), use 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de agar y 975 mL de agua desionizada. Autoclave. Enfriar a 55 °C, luego agregar estérilmente, en orden, 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M de CaCl₂, 1 mL de 5 mg/mL de colesterol en EtOH y 25 mL de 1 M de fosfato de potasio pH 6.0 en placas de Petri de 90 mm.
   1. Para 1 M de fosfato de potasio pH 6.0, use 108.3 g de KH₂PO₄ y 46.6 g de K₂HPO₄, y agregue agua desionizada a 1 L. Autoclave.
3. Extienda 1-2 mL del OP50 cultivado en las placas de agar NGM. Para hacer una capa delgada de OP50, incube las placas durante la noche a temperatura ambiente antes de agregar cualquier nematodo.
   nota: Las placas de agar NGM inoculadas OP50 pueden almacenarse a temperatura ambiente durante 2-3 semanas.
4. Añadir al menos 100 lombrices en una placa de agar NGM con OP50 y cultivar a 20 °C hasta la etapa adulta. Se requieren al menos tres placas.
5. Para recolectar huevos en el útero, transfiera hermafroditas grávidas de las tres placas de agar NGM, cada una con 5 mL de tampón S, en un tubo cónico de 15 mL, y lave los gusanos 3 veces con 15 mL de tampón S utilizando centrifugación a 300 x g durante 30 s a temperatura ambiente.
   1. Para hacer tampón S, use 5,9 g de NaCl y 50 mL de fosfato de potasio 1 M pH 6,0, y agregue 1 L con agua desionizada. Autoclave.
6. Disolver las lombrices en una solución alcalina de hipoclorito para la axenización y el aislamiento de huevos a granel (0,5 mL de lejía fresca o equivalente: 5-6% de hipoclorito de sodio, 0,1 mL de 10 M de NaOH, aproximadamente 4,5 mL de tampón S), y dejar reposar la solución durante 10-15 min a temperatura ambiente con mezcla por inversión.
   nota: Dentro de 15 minutos, los gusanos adultos deben disolverse, dejando una solución turbia de huevos liberados de sus cadáveres (los huevos liberados deben confirmarse con un microscopio estereoscópico). En lugar de 0,1 mL de NaOH 10 N, también se pueden utilizar 0,2 mL de NaOH 5 N.
7. Después del tratamiento con hipoclorito, lave el pellet de huevo 3 veces con 15 mL de tampón S y vuelva a suspender en 5-6 mL de tampón S. Eclosionar los huevos liberados durante una incubación nocturna a 20 °C en tampón S sin E. coli para un cultivo sincrónico por edad de larvas en estadio L1.
8. Para determinar el número aproximado de larvas en etapa L1, cuente los gusanos usando un microscopio estereoscópico en 10 μL de tampón S después de resuspender las larvas al menos 3 veces y calcule el promedio. A continuación, transfiera las larvas en estadio L1 a cinco placas de agar NGM con OP50 (1.500-3.000 gusanos por placa utilizando una placa de Petri de 90 mm), y cultive a 20 °C hasta que hayan crecido hasta la etapa de adulto joven, cuando comienza la autofecundación y se ponen algunos huevos (normalmente después de 3 días).

2. Extracción de fracción celular de C. elegans

1. Recoja los gusanos en etapa de adulto joven (animales de 5 días de edad) de las cinco placas de agar NGM con tampón S (Figura 1A).
   1. Para seleccionar solo lombrices vivas utilizando el método de sacarosa 6 para la flotación con 30% (p/v) de sacarosa, mezcle las lombrices suspendidas en 3-4 mL de tampón S con un volumen igual de sacarosa helada al 60% (p/v) en un tubo cónico de 15 mL. Girar el tubo a 1.500 x g durante 15 s a 4 °C y retirar los gusanos flotantes y colocarlos en un tubo nuevo moviéndolos fuera de la pared del tubo con una pipeta Pasteur.
2. Lavar las lombrices 3 veces con tampón S por centrifugación a 1.500 x g durante 30 s a 4 °C. Comprobar el volumen húmedo de las lombrices lavadas después de la centrifugación con una punta de micropipeta de 1.000 μL (Figura 1B).
3. Agregue los gusanos lavados a un volumen igual de ácido tricloroacético (TCA) al 10% (p/v) helado para la precipitación de proteínas (Figura 1C). En lugar de TCA, se puede utilizar ácido perclórico (PCA) o ácido metafosfórico.
4. Homogeneizar los gusanos con el precipitante utilizando 40 golpes de un mortero en un homogeneizador de teflón (trituradora de tejidos Potter-Elvehjem) con rotación de hasta 1.300 rpm sobre hielo.
5. Transfiera el homogeneizado a un microtubo nuevo de 1,5 ml con una pipeta Pasteur y sonique con un homogeneizador ultrasónico durante 3 minutos (3 veces de 1 minuto) con un ciclo de trabajo del 20% en hielo.
6. Clarificar el homogeneizado por centrifugación a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Neutralizar los sobrenadantes con 4 M de KOH (0,25 volumen al 10% TCA) durante 20 min en hielo, y centrifugar a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante (como muestra de ensayo) puede almacenarse a -80 °C hasta los siguientes ensayos.

3. Ensayo de lactato utilizando un kit de ensayo colorimétrico

1. Mida la concentración de lactato en las muestras de prueba utilizando un kit de ensayo colorimétrico (Tabla de materiales). Realice exámenes dúplex para las muestras de prueba. Agregue 5 o 10 μL de las muestras de prueba a una placa de 96 pocillos y ajuste el volumen a 50 μL por pocillo con el tampón de ensayo de lactato provisto con el kit.
2. Para la curva estándar de lactato, diluya 100 mM L(+)-lactato estándar a 1 mM con tampón de ensayo de lactato. Agregue 0, 2, 4, 6, 8 y 10 μL del estándar de 1 mM L(+)-lactato, que se proporciona con el kit, en una serie de pocillos.
3. Añada 50 μL de mezcla de reacción (que contenga 46:2:2 de tampón de ensayo de lactato, mezcla de enzimas de lactato y sonda de lactato en DMSO, anhidro; todos los reactivos se proporcionan con el kit) o mezcla de control de fondo (que contiene 48:2 de tampón de ensayo de lactato y sonda de lactato) en cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 30-60 minutos mientras las muestras están protegidas de la luz.
4. Mida la absorbancia de cada pocillo a 570 nm utilizando un lector de microplacas y reste la absorbancia de la mezcla de control de fondo de la absorbancia de la mezcla de reacción.
5. Traza la curva estándar de lactato. Calcule las concentraciones de lactato de las muestras de prueba a partir de la curva estándar de lactato.

Resultados

Figura 1. Proceso para la extracción de metabolitos celulares. (A) Se colocaron entre 1.500 y 3.000 gusanos en una placa de agar NGM (placa de Petri de 90 mm). La extracción de gusanos en cinco placas fue suficiente para los ensayos colorimétricos. (B) Los gusanos recolectados de las cinco placas de 3,000 y 1,500 gusanos por placa se indican en el la...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo colorimétrico/fluorimétrico de lactato	BioVisión	#K607-100	colorimétrico/fluorimétrico 100 ensayos; Almacenar a -20oC
ácido tricloroacético	Wako Químico Puro	#207-04955	Almacenar a temperatura ambiente
Homogeneizador de teflón	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	En lugar de Iwaki/Pyrex disponible por Wheaton