Ensayo espectrofotométrico para determinar la actividad de la glucógeno sintasa

Resumen

Fuente: Wilson W.A., Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota. J. Vis. Exp. (2021).

Este video describe un ensayo espectrofotométrico para la estimación de la actividad de la glucógeno sintasa. El método se basa en la reducción de la absorbancia de NADH con el tiempo e indica la actividad de la glucógeno sintasa.

Protocolo

1. Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa

1. Prepare las soluciones madre de los reactivos requeridos como se indica en la Tabla 1 (antes del día experimental).
2. El día del ensayo, prepare una solución de trabajo fresca de 4 mM de NADH disolviendo 4,5 mg de NADH en 1,5 mL de 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0. Almacenar en hielo, protegido de la luz.
3. Descongele soluciones madre de UDP-glucosa, ATP, fosfoenolpiruvato y quinasa NDP en hielo.
4. Precalentar un baño maría a 30 °C.
5. Configure cada ensayo de glucógeno sintasa en un tubo de 1,5 mL agregando los reactivos de la mezcla de reacción enumerados en la Tabla 2.
   nota: Para facilitar la configuración, se puede hacer una mezcla maestra que contenga suficiente cantidad de cada uno de los reactivos mencionados anteriormente para completar el número de ensayos previstos.
6. Prepare una reacción en blanco, donde el NADH en la mezcla anterior se reemplaza con agua. Transfiera a una cubeta de metacrilato desechable y utilícela para establecer el cero en el espectrofotómetro a 340 nm.
7. Tome 770 μL de la alícuota de la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mL. Añadir 2 μL de quinasa NDP y 2 μL de mezcla de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa, mezclar suavemente e incubar a 30 °C durante 3 min para precalentar la mezcla de reacción.
8. Añadir 30 μL de la muestra que contiene glucógeno sintasa en tampón Tris de 20 mM, pH 7,8; mezclar y transferir la mezcla de reacción a una cubeta de metacrilato desechable.
9. Coloque la cubeta en el espectrofotómetro y registre la absorbancia a 340 nm a intervalos cronometrados durante 10 a 20 min. Trace las absorbancias obtenidas en función del tiempo.
   nota: Se debe llevar a cabo una reacción en la que la muestra de glucógeno sintasa se reemplaza con 20 mM de tampón Tris para controlar la oxidación no enzimática del NADH. Dependiendo de la pureza de la muestra, pueden ser necesarias otras reacciones de control.
10. Determine la velocidad de reacción.

Tabla 1: Soluciones madre necesarias para el ensayo de la actividad de la glucógeno sintasa.

componente	Direcciones
50 mM Tris pH 8.0	Disuelve 0.61 g de base Tris en ~ 80 mL de agua. Enfriar a 4 °C. Ajustar el pH a 8,0 con HCl y aumentar el volumen hasta 100 mL con agua.
Tampón HEPES de 20 mM	Disuelve 0,477 g de HEPES en ~ 80 mL de agua. Ajuste el pH a 7.0 con NaOH y aumente el volumen a 100 mL con agua.
Tampón Tris/32 mM KCl pH 7,8	Disuelve 1,94 g de base Tris y 0,239 g de KCl en ~90 mL de agua. Ajuste el pH a 7,8 con HCl y aumente el volumen a 100 mL con agua.
0,8% p/v glucógeno de ostra	Pesar 80 mg de glucógeno de ostra y añadir al agua. Aumente el volumen final hasta 10 ml con agua y caliente suavemente/mezcle para disolver completamente el glucógeno.
100 mM UDP-glucosa	Disuelva 0,31 g de UDP-glucosa en agua y haga que el volumen final sea de hasta 1 mL. Conservar en alícuotas, congelado a -20 °C. Estable durante varios meses.
50 mM ATP	Disuelve 0.414 g de ATP en ~ 13 mL de agua. Ajuste el pH a 7,5 con NaOH y aumente el volumen a 15 mL con agua. Conservar en alícuotas congeladas a -20 °C. Estable durante varios meses.
100 mM de glucosa-6-fosfato pH 7,8	Disuelva 0,282 g de glucosa-6-fosfato en ~ 7 a 8 mL de agua. Ajusta el pH a 7,8 con NaOH. Aumente el volumen hasta 10 ml con agua. Conservar congelado en alícuotas a -20 °C. Estable durante al menos seis meses.
40 mM de fosfoenolpiruvato	Disuelva 4 mg de fosfoenolpiruvato en 0,5 mL de tampón HEPES de 20 mM pH 7,0. Almacenar a -20 °C. Estable durante al menos 1 semana.
0,5 m MnCl2	Disuelve 9,90 g de MnCl2 en un volumen final de 100 mL de agua.
Quinasa NDP	Reconstituye el polvo liofilizado con suficiente agua para dar una solución de 1 U/μl. Preparar alícuotas, congelar en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C. Estable durante al menos 1 año.

Tabla 2: Composición de la mezcla de reacción para el ensayo de la actividad de la glucógeno sintasa.

componente	Volumen (μl)
Tampón Tris/32 mM KCl pH 7,8	250
Agua	Artículo 179
100 mM de glucosa-6-fosfato, pH 7,8	58
0,8 % p/v de glucógeno de ostra	Artículo 67
50 mM ATP	80
4 mM de NADH	80
100 mM UDP-glucosa	28
40 mM de fosfoenolpiruvato	20
0,5 m MnCl2	8
Volumen final	770

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amilopectina (libre de amilosa) del maíz ceroso	Fisher Científico	A0456
amilosa	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP: sal disódica	MilliporeSigma	A3377
D-glucosa-1,6-bisfosfato, sal de potasio	MilliporeSigma	G6893
D-glucosa-6-fosfato, sal sódica	MilliporeSigma	G7879
Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, grado I, de levadura	MilliporeSigma	10127655001
Glucógeno tipo II de la ostra	MilliporeSigma	G8751
hexoquinasa	MilliporeSigma	11426362001
Cubetas de metacrilato, 1,5 mL	Fisher Científico	Teléfono 14-955-128	El metacrilato es necesario ya que algunos procedimientos se realizan a 340 nm o menos
β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato sodio sal	MilliporeSigma	N0505
β-nicotinamida dinucleótido de adenina, sal disódica reducida	MilliporeSigma	43420
Nucleósido 5'-difosfato quinasa	MilliporeSigma	N0379
Fosfoenolpiruvato, sal monopotásica	MilliporeSigma	P7127
Fosfoglucomutasa del músculo de conejo	MilliporeSigma	P3397
Fosforilasa A del músculo de conejo	MilliporeSigma	P1261
Enzimas piruvato quinasa/láctica deshidrogenasa del músculo de conejo	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucosa, sal disódica	MilliporeSigma	U4625